1。4 目标菌株鉴定

随着分子生物学的发展，人类发现不同菌种都包含特定的保守序列，这对于通过基因层面来鉴定菌种有重大意义。不同菌种内都包含着在进化过程中高度保守的基因序列，例如核糖体上16S rRNA上存在一段高度保守的基因序列，16S rDNA就是编码该亚基的基因，现已作为细菌系统分类研究中最有用和最常用的分子钟。对于不同的细菌，一般在基因组上都存在除了16S rRNA以外的特征序列，例如，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的comK基因[6]。当然对于已经进行过全基因组测序的细菌可以用16S rRNA基因以外的特异性基因进行鉴定。

1。4。1 comK基因的PCR鉴定

comK基因是芽孢杆菌特有的形成感受态的相关基因。如果能够成功扩增出comK基因，那么就已经基本确定此菌株为枯草芽孢杆菌。ComK是感受态转录因子，它可以激活自身转录，同时能使晚期感受态基因开始转录，从而开启一系列对外源DNA吸收重组的功能。

枯草芽孢杆菌的comK基因全长约600 bp。以下是经相关文献[7]比对comK的同源序列，再经BioEdit软件设计的引物：

正向引物序列：ATGAGTCAG来;自]优Y尔E论L文W网www.chuibin.com +QQ752018766-CAGACGC

反向引物序列：ATACCGTTCCCCGAGCTCACG

PCR反应体系如表1

表1  20 μL PCR反应体系

组分 用量(μL)

MIX 10

ddH2O 8

Primer A 0。5

Primer B 0。5

DNA 模板 1

Total 20

PCR扩增程序：94 ℃  2 min预变性；94 ℃  30 s变性；56 ℃  30 s退火；72 ℃  1 min延伸；30次循环。MIX中包含Taq酶（扩增效率每分钟1 kb）、镁离子、dNTP等。

1。4。2 16S rRNA基因的PCR鉴定

枯草芽孢杆菌的16S rRNA基因 PCR扩增的特异性引物是一对通用的保守引物，全长为1466 bp，引物序列如下。

16S-27F：  AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 

16S-1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT 

由于所用Taq酶的效率为每分钟1 kb，反应体系中引物为16S通过引物以及PCR程序中延伸时间设定为1。5 min，其他都与comK基因的PCR操作相同。一般来说，16S rRNA基因的通过引物能扩增绝大多数细菌。操作流程规范正确都能在凝胶电泳成像中显示条带。文献综述

1。5 pUB110质粒的提取

选用pUB110作为转化的外源DNA，是由于pUB110本身具有分子量小、拷贝数高、有适合筛选的抗性标记等优点[8]。此质粒有双抗性标记分别为氯霉素和卡那霉素。质粒保存在168枯草芽孢杆菌中。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，用试剂盒法抽提质粒之前，需要溶菌酶对目标菌株进行破壁，每个离心管加入浓度为50 mg/mL的溶菌酶30 μL，水浴37 ℃、30 min，后续操作严格按照试剂盒的说明书进行。本实验选用上海生工生物工程股份有限公司的质粒DNA抽提试剂盒。

1。6 感受态细胞制备与验证

枯草芽孢杆菌作为工业酶生产的主要菌种，十分有必要寻找或者改造更具高质量、高效力的菌株。上述的三种转化方法中，原生质体转化法条件苛刻，电转化法效率好，但对设备要求较高[12]。实验室中多对Spizizen构建的枯草芽孢杆菌转化系统加以改进，从而优化枯草芽孢杆菌的转化效率以及蛋白质表达量。本实验侧重从外界寻找高转化率的菌株，为构建并完善优良转化载体以及提高产物表达量提供可能性。将已鉴定的枯草芽孢杆菌进行感受态诱导，本实验采用Spizizen转化法进行感受态转化，转化效率一般为200~800 CFU/μg质粒DNA[9]。