摘    要：随着人们保健意识的提高，作为一种安全有效的保健品，氨基葡萄糖正受到越来越多的关注。酸水解法、甲壳素酶水解法和微生物发酵法是三种目前主要的氨基葡萄糖生产方法。随着时代的发展，微生物发酵法展现出了越来越多的优势。本实验就是采用了一种N-乙酰氨基葡萄糖酶水解N-乙酰氨基葡萄糖得到终产物氨基葡萄糖的微生物发酵法。前期已克隆得到一种编码N-乙酰氨基葡萄糖酶的基因Tk，本文旨在通过探究启动子、诱导剂浓度、诱导温度、金属离子四个因素对酶表达的影响来实现酶表达的优化。实验最终结论是Tk酶较好的表达条件是采用pTV118N的启动子，添加0.2 mM IPTG，不加金属离子，并于37℃下诱导表达，此条件下酶活能达到25.85 ± 2.22 U/ mL。

With the improvement of people's health awareness, glucosamine is attracting more and more attention as a safe and effective health care product. Acid hydrolysis, chitinase hydrolysis and microbial fermentation are the three major current glucosamine production methods. With the development of the times, microbial fermentation has showed more and more advantages. In this experiment, an enzyme for deacetylating N-acetylglucosamine was used to hydrolyze N-acetyl glucosamine to obtain the final product glucosamine fermentation. Previously, a gene Tk encoding N-acetylglucosamine has been cloned. This article aims to optimize the expression of this enzyme by exploring the influence of promoter, concentration of inducing agent, induction temperature, and metal ions on enzyme expression. The final conclusion of the experiment is that the better expression condition of Tk enzyme is to use pTV118N promoter, add 0.2 mM IPTG, without metal ions, and induce expression at 37°C. Under this condition, the enzyme activity reaches 25.85 ± 2.22 U/mL.

关键词：脱乙酰酶 ；表达优化 ；N-乙酰氨基葡萄糖

Keyword: deacetylase ; expression optimization ; N-Acetyl-Glucosamine

目    录

引言 5

1实验材料与方法 7

1.1实验材料 7

1.1.1质粒 7

1.1.2 感受态细胞 7

1.1.3 试剂和溶液 7

1.1.4 培养基 9

1.1.5仪器与设备 10

1.2实验方法 10

1.2.1 质粒转化、菌种活化及保存 10

1.2.2 酶的表达 11

1.2.3 SDS-PAGE分析 12

1.2.4 酶活测定 13

2实验结果与分析 14

2.1 SDS-PAGE分析 14

2.2 启动子对酶表达的影响 14

2.3 诱导剂浓度对酶表达的影响 15

2.4 诱导温度对酶表达的影响 15

2.5 金属离子对酶表达的影响 16

2.6 结论 16

3 讨论 16

引言

过去20年来，全球已进入老龄化加速时期，除部分发达国家外，我国也已进入老龄化时期，尤其沿海大城市60岁以上老年人占了相当的比列。老年人最容易患的几种退行性疾病包括眼病、骨骼疼痛及心血管疾病等。其中骨关节疼痛最易影响老人的活动能力及生活质量[1]。而氨基酸葡萄糖是构成关节软骨的主要成分，是一类广泛存在于人和动物软骨、肌腱和韧带中的天然氨基葡萄糖，能够预防和改善骨关节病[2]。如今氨基葡萄糖作为目前重要的关节炎保健品，市场需求量也在大幅提升[3]。