酵母中海藻糖提取工艺研究+文献综述(4)
本课题研究酵母中海藻糖的提取工艺，对比不同提取方法、纯化方法得出最优的工艺条件，优化海藻糖生产技术提高海藻糖的产量。简单先进的提取工艺可以使本市的海藻糖产量以及废酵母的处理有长足的进步。
图1.1 常见海藻糖生产流程
2 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌种和培养基
6种酵母菌种均来自上海引用技术学院微生物实验室，1号菌种分离自林下土壤，2号菌种分离自林下腐叶，3号菌种分离自河床淤泥，4号菌种为安琪黄酒酵母，5号菌种为哈尔滨酿酒酵母，6号菌种为安琪果酒酵母。将6种酵母菌分别加入LB液体培养基活化2h。
挑取一环活化后的菌到灭过菌的PDA斜面上画线涂布，28℃培养48小时待菌落成长后冷藏待用。产海藻糖培养基、PDA培养基均购自国药集团股份有限公司。产海藻糖培按照葡萄糖30g, 酵母浸出粉4g, (NH4)2•SO4 4g, KH2PO4 0.18g, Na2HPO4 3g, MgSO4 0.12g, 微量元素溶液3mL(微量元素溶液( / L) : MnSO4 30mg, FeSO4•7H2O 30mg, CuCl2•2H2O 34mg, ZnCl2 30mg,Na2MoO4•H2O 30mg, CaCl2•6H2O 38mg, NiCl2 20mg,NaCl 30mg, CoCl2•6H2O 200mg。)以上培养基在自然pH 的条件下, 121℃灭菌20min, 葡萄糖单独灭菌。PDA培养基按照胰马铃薯 (加水煮烂后过滤)200g/L，葡萄糖 20g/L，琼脂20g/L配置完成121℃高压灭菌20min后摆斜面。
PCA(平板计数琼脂) 购自上海盛思生化科技有限公司。配置方法为称取本品23.5g，加入去离子水定容至1L，边搅拌边加热直至煮沸并且完全溶解，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。
2.1.2 试剂
蒽酮-硫酸试剂，称取2g蒽酮加入到80%H2SO4中，用80%H2SO4定容至1L。
三氯乙酸（BR）、无水乙醇（BR）、硫酸（BR）、蒽酮（BR）、海藻糖（BR）均购自上海国药集团股份有限公司。
2.1.3 主要仪器
表2-1实验中所用主要仪器与设备
名称 规格 生产厂家
移液枪 10-100、100-1000 大龙医疗设备（上海有限公司）
生化培养箱 SPX-150B-Z 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
紫外可见分光光度计 WFZ UV-2100 上海优尼柯仪器有限公司
立式压力蒸汽灭菌锅 LS-B50L 上海医用核子仪器厂
电子天枰 MP200B 上海精科实验有限公司
血球计数板 XB-K-25 上海求精生化仪器有限公司
电热恒温水浴锅 HWS12 上海恒科仪器设备有限公司
全文震荡培养箱 HZQ-F160 太仓市实验设备厂
数显鼓风干燥箱 GZX-9426MBE 上海博讯实验有限公司医疗设备厂
2.2 分析方法
海藻糖测定采用蒽酮-硫酸法，将待测液加蒸馏水至2mL，加入8mL蒽酮-硫酸试剂，沸水浴2min。590nm出测定吸光度。
菌体破壁率计算方法采用平板技术法，将破碎后的菌体加蒸馏水至10mL，震荡，混悬，去50μL涂平板，培养24h后技术。对照组采用未经过破壁处理的原始菌液称取1g（ww）加10mL蒸馏水取50μL涂平板，培养24小时候计数，两者之比为破碎率。
菌体浓度的测定采用比色法。在580nm处测定吸光度。
2.3 实验方法
2.3.1 生产菌株的确定
将6瓶灭菌后的产海藻糖培养基标号，6个斜面上的菌种分别取1环接种至对应的产海藻糖培养基。30℃，200rpm，培养24h。将培养后的菌悬液过滤，分别称取1g菌体，加入30mg蜗牛酶，加蒸馏水至10mL，37℃水浴，缓缓搅拌5min。2500rpm离心5min取上清。沉淀加入0.5mol/L三氯乙酸溶液15mL冰水浴下浸提3次。将上清液与浸提液混合，取2mL上述溶液加入8mL蒽酮-硫酸试剂沸水浴加热5min，以蒸馏水作为空白对照。