酵母中海藻糖提取工艺研究+文献综述(5)
2.3.2 测定生产菌株生长曲线
在选定菌株斜面培养基上挑取一环接种至产海藻糖培养基中，以空白培养基做对照，OD560测定其吸光度绘制生长曲线。在2h时开始取样，前24h每隔4h取样一次，24h之后每隔12h取样一次。
2.3.3 选择破壁方法
尝试四种不同破壁方法对酵母细胞壁的破碎情况，以涂布PCA平板计数，1g菌体重悬在10mL蒸馏水中做参照，计算破碎率。
（1）酶法破壁
取1g（ww）已经积累海藻糖（高温胁迫使酵母积累海藻糖）的酵母菌加入10mL蒸馏水，再加入30mg蜗牛酶。恒温37℃水浴15min将处理后的菌液重悬，取50μL涂PCA平板。
（2）冻融法破壁
取1g（ww）酵母菌已经积累海藻糖的酵母菌，加10mL蒸馏水，放入冰箱-16℃冷冻，待完全冻结后30℃温水浴融解。如此反复四次，重悬菌液后取50μL涂PCA平板。
（3）研磨法破壁
将1g（ww）积累了海藻糖的菌体加入到研钵中，缓慢研磨。顺时针30次，逆时针30次，反复30min。仔细刮去粘在研钵表面的菌体加入10mL蒸馏水缓缓洗脱。取50μL涂PCA平板。
（4）微波法破壁
将1g（ww）菌体用接种环平铺在平板上铺成薄薄的一层，放入微波炉中微波处理2500MHz，700W下3min。加入10mL蒸馏水重悬。取50μL涂PCA平板。
2.3.4 绘制海藻糖标准曲线
准确称取0.100g标准海藻糖加入蒸馏水定容至100mL。用移液枪分别取0、25、50、100、150、200μL，分别加水至2.0mL，摇匀后加入蒽酮硫酸试剂8.0mL。沸水浴2min测定OD590。
2.3.5 选择提取方法
将1g酵母菌体微波破碎2500MHz，700W下4min，将经过破壁处理的菌体加水至10mL混匀然后在3000rpm下离心，上清液保留待用。沉淀加入三种不同的提取剂8mL，三氯乙酸、水、乙醇。三氯乙酸在冰水浴中进行，乙醇和水在常温下进行。反复抽提3次，每次20min。最后加入上清液，用蒽酮-硫酸试剂测定海藻糖含量。
2.3.6 优化提取工艺
将最优的破壁方法作为破壁手段，提取剂采用三氯乙酸，设计三因素三水平正交实验表。因素选择三氯乙酸浸提时间、离心转速、微波处理时间。
2.3.7 海藻糖含量确定
采用蒽酮-硫酸法，将提取后的溶液取200μL加水至2mL，加入提取剂浸提3次每次20min，加入蒽酮-硫酸试剂8mL，沸水浴2min测定590nm处的吸光度。对照标准曲线读出海藻糖含量扩大相应倍数即可得出海藻糖量。
3 结果与讨论
3.1 产海藻糖菌株的确定
将6瓶培养后的酵母计数，测定其菌悬液大致浓度，菌体浓度的不同会使海藻糖的产量不同。6中菌体过滤后各称取1g菌体（ww）采用酶法破碎，用蒽酮-硫酸法测定海藻糖含量，结果4号菌体海藻糖含量最高。选定其为海藻糖生产菌株，后续实验都采用保存在-20℃下的4号菌斜面。
表3-1 1g菌种海藻糖24h内海藻糖产量
菌种 培养时间 菌悬液浓度 OD值 海藻糖含量/mg
1 24h 6.0×105 0.17 4.3
2 24h 7.2×105 0.40 10.32
3 24h 1.3×106 0.42 10.84
4 24h 0.6×106 0.57 14.7
5 24h 9.1×105 0.44 11.4
6 24h 4.3×105 0.28 7.2
3.2 酵母生长曲线的测定
从冷冻保存的4号菌斜面挑取一环菌体，接种至产海藻糖培养基，使用产海藻糖培养基是因为不同培养基可能对酵母的生长产生影响，进而影响其延滞期、生长期的时间和长度。在18h时菌体浓度最高，之后进入稳定期。海藻糖积累在生长期因为生长期胞内物质代谢水平高并且为了能够文持菌体生长，接受到外界环境的刺激后酵母会积累海藻糖以对抗不理环境。以后的培养都在生长期提取海藻糖。