真空包装熟制禽肉中腐败菌的潜能分析(2)
1 材料与方法
1．1 实验材料
零售熟制禽肉样品44份，购于南京的各大超市、农贸市场、卤菜店共计11个采样地点（图1）。其中熟制鸡爪5份，熟制鸭爪1份，熟制鸭翅9份，熟制翅根2份，熟制鸡腿1份，熟制鸭腿1份，熟制翅尖2份，盐水鸭8份，酱鸭5份，牦牛肉2份，盐水肫2份，白斩鸡1份，烧鸡2份，盐鸡3份。
1 采样点分布
1．2 试剂与仪器
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、细菌琼脂粉 青岛高科园海波生物技术有限公司。
氯化钠、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠 南京化学试剂股份有限公司。
磷酸盐缓冲液（pH 7.2，0.1M）：0.2M磷酸二氢钠水溶液28.0mL中加入0.2M磷酸氢二钠水溶液72.0mL，加水定容至200mL。
用于PCR 扩增的全套试剂和扩增引物，上海生工生物工程技术服务有限公司。
真空充气包装机（浙江葆春包装机械总公司）；生物安全柜，The Baker Company；均质拍打机，法国Interscience公司；TGL-16B离心机，上海安亭科学仪器厂；HPP 260培养箱，德国Memmert公司；梯度PCR仪，美国Applied Biosystems公司；Mixing Block MB-102恒温振荡金属浴，杭州博日科技有限公司；HWE-50高压蒸汽灭菌锅，日本Hirayama公司。
1．3 方法
1. 3. 1 样品前处理及取样 将市场购买来的样品进行真空包装后，放置于12℃条件下放置，待有明显腐败现象（出汁、涨袋、变色、发粘等）时取出。在无菌条件下每份样品中取出25g（挑去骨头），同时加入125ml无菌生理盐水，置于均质袋中均质，洗脱菌体。
1．3．2 细菌分离 接种环蘸取菌液接种于TSA平板上，分区划线。每份样品取三块TSA平板于28℃需氧条件下培养24~48h，另取三块TSA平板于28℃厌氧条件下培养24~48h。于不同培养条件下的每份样品中各挑取3株长势良好、典型生长的菌落，在TSA平板上分区划线，对样品的菌株进行分离纯化直至得到最终的单菌落。
1．3．3 菌落形态的观察 观察并记录已经分离纯化的单菌落的形态，其中包括菌落的颜色、大小、形状、光泽、边缘、透明度、隆起度、质地、表面状态等。
1．3．4 煮沸法[5]提取细菌基因组DNA 取TSB菌液1ml，12000 r /min离心5min富集菌体，弃去上清液，加入100μL的无菌水，涡旋混匀，100℃金属浴8min后立即冰浴8~10min，8000r /min 离心4min，以上清液为模板，－20℃保存备用。
1． 3． 5 16S rDNA法[7]鉴定腐败菌 以27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) 为引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增菌株的16S rDNA基因。反应体系为25μL：GoTaq Green Master Mix (2×)12.5μL；上下游引物各1 μL，模板DNA4μL，加无菌去离子水补至25μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10 min；结束后4℃保温。将扩增成功的样品送至生物公司进行测序处理，测序引物与扩增引物相同，测序长度为1500 bp左右。将所得序列置于NCBI网站进行BLAST比对，获得相似性98%以上的菌株，使用MEGA5.10和Clustalx软件构建系统发育树。
2 结果分析与讨论
2．1 细菌菌落特征
本试验共分离出292个菌株。通过对菌株在TSA平板上培养的单个菌落形态进行观察分析，结果如表1。由表可知，分离出的菌株虽然形态不一，但菌株的颜色主要是乳白色、白色和黄色，还有少量的菌株是红色，形状多为规则的圆形，隆起度分为平、微隆、低凸、凸起，菌株的边缘多为整齐，表面多为光滑，大小从针尖状到中到大都有，而其中厌氧培养下的菌株大都比需氧条件下培养的菌株小。此外，存在不同类型的肉品分离出的菌株形态一致，如A-1-4Y和A-4-5Y；也存在不同采样地点同种肉品中分离出的菌株形态一致，如A-5-2和A-11-3；还存在不同培养条件下的样品分离出的菌株形态一致，如B-12-6Y和C-3-2。
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