牛骨蛋白酶解工艺研究(3)
甲醛溶液 分析纯，国药集团化学试剂有限公司
2.2 试验仪器
仪器名称 型号 制造商
电子天平 PL203 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
pH计 pHS-3C 上海精密科学仪器有限公司
磁力搅拌器 84-1 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司
手持糖量计 WYT-4型 泉州中友光学仪器有限公司
超级恒温水浴锅 601 上海森地科学仪器设备有限公司
冰箱 BCD-204WE型 上菱无霜冷藏冷冻箱
高速离心机 CT15RT Centrifuge ,Techcomp
液相色谱质谱联用仪 LC-MS 1000 江苏天瑞仪器股份有限公司
2.3 试验方法
本试验中底物浓度为固液比（牛骨粉质量与水质量之比），酶添加量为底物的质量百分比。
2.3.1 原料的预处理
对买来的新鲜牛骨进行清洗，破碎处理，然后放于0.1MPa条件下蒸煮3h，随后放于烘箱50℃烘制6h。用粉碎机粉碎后进行过筛，选取较细致的骨粉进行冷冻储藏，方便后面试验使用。
2.3.2 牛骨酶解液的制备
将牛骨粉从冰箱中取出，称量后置于酶反应器中，加入一定比例的去离子水， 连接超级恒温水浴并搅拌。调节至最佳的pH，等酶解罐中温度恒定时，加入适量的酶制剂。待酶解过程全部完毕后，将进行100℃，8min灭酶，最后在4000r的转速下对酶解后的混合物进行离心20min，取上清液，即为最终所需酶解液。本试验的复配组合为：猪胰脂肪酶+木瓜蛋白酶（固定木瓜蛋白酶的条件不变，分别优化猪胰脂肪酶的酶解条件），一鸣脂肪酶+木瓜蛋白酶（固定木瓜蛋白酶的条件不变，分别优化一鸣脂肪酶的酶解条件），猪胰脂肪酶+木瓜蛋白酶（固定猪胰脂肪酶为最适酶解条件不变，优化木瓜蛋白酶的酶解条件），猪胰脂肪酶+复合蛋白酶+风蛋白酶（固定猪胰脂肪酶和风蛋白酶为最适酶解条件不变，优化复合蛋白酶的酶解条件）。
2.3.3 水解度测定-甲醛滴定法
水解度在一定程度上反映了酶解反应进行的程度[12] ，这是因为当反应进行到一定阶段，酶解反应的加剧主要使蛋白质水解后的肽进一步转化为小肽和氨基酸，表现为水解度的增大，而并不显著增加总氮回收率；同时，在反应的一定阶段内，蛋白质水解生成多肽类，总氮回收率较高。但由于游离氨基酸较少，水解度亦不会呈现高值，故此次试验以水解度为指标,衡量水解程度。
取酶解上清液10mL+蒸馏水60mL→混匀→滴0.1mol/l氢氧化钠溶液至pH8.2→加入10mL甲醛→用0.1mol/l氢氧化钠溶液滴定至pH9.2→读取0.1mol/l氢氧化钠溶液用量。
水解度是指水解肽键的百分比，公式如下：
(1)
式中：C－氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
V1－样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
V2－空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
m－样品的质量，g；
V－酶解上清液的体积，mL；
0.014－氮的毫摩尔质量，g/mmol．
8－每克蛋白质所含的肽键的毫摩尔数（mmol/g）．
2.3.4 试验设计
试验前期，参考酶解资料文献[11-19]，查找猪胰脂肪酶、一鸣脂肪酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和风蛋白酶在各自最适的酶解温度、酶解时间、pH 值和酶用量、底物浓度。为后面试验的优化提供参考数据。
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