八种消毒剂对大肠杆菌和葡萄球菌杀灭效果的研究(2)
本实验以大肠杆菌和葡萄球菌为研究对象，研究不同浓度的八种消毒剂在不同的作用时间、作用温度下对大肠杆菌和葡萄球菌的杀灭作用，旨在研究这几种消毒剂的有效杀菌浓度和持续杀菌作用时间，为养殖场、公共场所、设备器械等的净化提供理论依据[3]。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，为江苏省农业科学院兽医研究所家禽重大疫病防控研究室分离保存。
1.1.2消毒剂
江苏立华牧业股份有限公司研制生产未上市的八种消毒剂（5%戊二醛+5%癸甲溴铵[4]或10%戊二醛+10%癸甲溴铵[5]），编号分别为LH1、LH2、LH3、LH4、LH5、LH6、LH7、LH8。
1.1.3.培养基、营养液、细菌悬液、生理盐水
普通营养琼脂培养基，pH7.2。参照《兽医微生物学实验指导》（2013）实验室自配[6-8]；LB营养液，pH7.0；细菌繁殖体与细菌芽孢悬液的制备方法。实验室自配[9]；0.9%生理盐水自配[10]，pH6.8-7.0。
1.1.4仪器
高压灭菌器、超净工作台、生物安全柜、玻璃平板、恒温箱、超纯水机等。
1.2方法
1.2.1细菌扩增培养、细菌悬液稀释
配制500ml普通琼脂培养基，方法参照附录A。配置2份200ml LB营养液，方法参照附录B。200ml0.9%的生理盐水，以每100ml/瓶的量分装。用报纸将干净平板包裹。然后在高压灭菌器中以90kpa压力121℃下高压20min[11]。
用酒精棉球消毒手与手臂，在超净工作台内倒适量的平板，等待培养基冷却。将两份3ml的大肠杆菌菌液和葡萄球菌菌液各加入到已冷却的两瓶200mlLB营养液中并标记，在37℃，转速为60r/min下培养12h。时间一到，接着在超净工作台内用生理盐水将培养12h的大肠杆菌菌液和葡萄球菌菌液进行稀释，稀释浓度分别为10-7、10-8、10-9并作标记[12-14]。用移液器分别吸取300μL不同稀释浓度的大肠杆菌和葡萄球菌菌液并注射到平板上（做标记），左右倾斜震荡平板使菌液在培养基上铺平。将用记号笔做好标记的平板放到温箱中，37℃倒置培养24h。到时间后观察平板菌落生长情况并记数[15]。
每个单细胞生长繁殖而形成单个的菌落，即一个单菌落代表原样品中的一个单细胞，所以统计菌落数根据其稀释倍数和取稀释后菌液的量即可换算出样品中的含菌数。但是由于菌液往往不易完全分散成单个细胞，所以长成的一个单菌落也可能来自样品中的多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。所以重复实验很有必要。为了准确地阐述平板菌落计数的结果，所以本次细菌平板培养每个稀释浓度对应做10个平板，取最终平均值可得到较准确的菌落数。
以每300μL含有2×105个细菌个数为标准浓度，将37℃培养12h的大肠杆菌菌液和葡萄球菌菌液进行稀释：已知大肠杆菌菌液需要的稀释倍数为1：750，葡萄球菌菌液需要的稀释倍数为1：75，取两瓶100ml高压灭菌的生理盐水，在超净工作台内，用移液枪先从其中一瓶生理盐水中吸取25.1ml弃去，剩余74.9ml，再从另一瓶中吸取26ml弃去，剩余74ml，换枪头，吸取0.1ml大肠杆菌菌液加入到74.9ml生理盐水中并用记号笔作标记，吸取1ml葡萄球菌菌液加入到74ml生理盐水中并用记号笔作标记。完成稀释[16]。
1.2.2消毒剂灭菌实验过程
配制若干体积普通琼脂培养基，方法参照附录A。若干 体积0.9%的生理盐水，以每100ml/瓶的量分装。用报纸将干净平板包裹。然后在高压灭菌器中以90kpa压力121℃下高压20min[17]。
消毒手与手臂，根据实验设想在超净工作台内倒适量的平板，等待培养基冷却。等待冷却期间，用高压的0.9%生理盐水分别稀释八种不同消毒剂，稀释比分别为：1：250，1：500，1：1500或1：50，1：100，1：500，1：1000或1：1000，1：1500，1：3000或1：25，1：50，1：100等。从稀释好的不同浓度消毒剂中分别取0.3ml与结果与分析2.1步骤稀释好的菌液0.3ml混合（此时得到消毒剂的最终稀释浓度），同时开始计时，并分为两份，分别在4℃和室温下作用15分钟和30分钟。最后从到时间的消毒剂和细菌混合液中吸取0.3ml注射到已降至室温的平板中（记号笔做标记），用玻璃棒推平。将平板放于37℃温箱中，倒置培养24h观察有无菌落生长记录并计算杀菌率[18]。
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