CZ130302新型猪链球菌株ChzM-TolA基因缺失株的构建(2)
按照荚膜抗原的血清学分类方法，目前共有35个猪链球菌的血清型(1-34型和1/2型)，此外还存在大量不属于现有血清型的菌株。CZ130302菌株是2013年，由南京农业大学潘子豪等，于江苏常州某猪场大量患病死亡仔猪脑组织中分离培养获得的一株细菌，通过生化鉴定，结合16S rRNA基因[6]和谷氨酸脱氢酶基因(gdh)的测序鉴定，确定该分离株为猪链球菌，电镜观察CZ130302株有荚膜结构，经过参考血清的凝集试验和多重PCR分型鉴定方法进一步确定该分离株不属于现有的任一血清型[7]。
从前，大多学者认为细菌的某一毒力因子对疾病的发生发挥着决定性作用，打破了人类对细菌致病性的认知的突破性研究进展，便是毒力岛的发现。毒力岛使人类认识到细菌的毒力远比想象的要复杂。病原菌入侵宿主的过程，事实上是一个动态的、繁杂的多个因子相互作用的过程，只有在病原菌的众多毒力基因表达产物协调一致的情况下，才能达到毁坏机体已经建立的免疫系统，或者与宿主的免疫系统实现共进化的目的，才能够实现细菌的侵袭。研究发现，病原菌只有在成功逃避宿主的免疫系统、并获得自身增殖存活所必需的营养成分后，才可能在体内生长繁殖。然而，宿主体内外的环境存在相当明显的差异，细菌为了适应这种差异，会调节某些基因的表达模式，作出适应性变化：下调非必需基因的表达，上调在感染宿主的毒力基因和宿主体内生长繁殖中的必需基因的表达。目前，国内对毒力岛的研究还处于刚刚起步的阶段，猪链球菌毒力岛的研究大都集中于SS2[8]，有关新血清型CZ130302株的研究很少。因此，本项目拟以CZ130302 50K毒力岛上的单个基因为研究对象，研究新血清型CZ130302株的毒力相关基因。该基因为猪链球菌CZ130302基因组50K毒力岛的一段特殊序列，位于开放阅读框ORF1063的位置，其碱基序列在902805起始，至905156终止，该基因编码783个氨基酸的假设蛋白。通过ChzM-TolA基因编码的假设蛋白ChzM-TolA与NCBI数据库中其他菌种的功能性蛋白比对发现，该假设蛋白与肺炎链球菌（S. pneumoniae）TolA蛋白(cell envelope integrity inner membrane protein TolA)同源性高达60%，与鼠链球菌（S. mitis）FBPS纤连蛋白(Fibrinogen blinding protein)同源性高达68%，而TolA和鼠链球菌FBPS纤连蛋白均为致病性蛋白，特别是鼠链球菌纤连蛋白FBPS具有Fn结合活性，在鼠链球菌的感染中发挥着非常关键的作用。而且，在猪链球菌2型毒力因子的研究中，FBPS被证实为是一种表面与分泌蛋白，为重要的毒力因子[9-13]。综上，猜测该基因为毒力相关基因，编码的蛋白为毒力相关蛋白，即ChzM-TolA蛋白可能是新血清型猪链球菌株CZ130302感染吸附过程中一个重要的参与蛋白。因此，本文中命名该基因为ChzM-TolA。
CZ130302菌株能否感染宿主并致病或者致死的关键在于它能否黏附、定植、并突破上皮细胞障碍，进入血液并存活，继而侵袭不同的组织器官，引起炎症。细菌与宿主细胞的黏附并非一个简单的过程，在细菌和细胞表面都有多种相关因子参与了此过程，因此研究在此过程中发挥作用的关键因子可能会对 CZ130302致病机理阐释发挥重要作用。
1 材料
1．1 菌株及培养条件
新型猪链球菌株CZ130302为2013年5月本实验室于江苏常州某猪场分离得到，由本实验室鉴定并保存，该菌株一般生长于THB液体培养基或平板上，37℃、5%CO2培养箱培养或者恒温振荡器振荡培养，在含有5%无菌绵羊血的THB平板上长势更佳。
将含有pSET4s质粒的大肠杆菌DH5a菌株（实验室冻存）培养于LB液体培养基或者平板上，培养基内加入终浓度为50ug/ml的壮观霉素、37℃恒温振荡器振荡培养常规培养。
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