猪萨佩罗病毒RT-PCR检测方法的建立与应用及基因组序列测定与分析(2)
1.8 临床样品检测 4
1.9 Sapelovirus cDNA全长测序及分析4
2 结果与分析 4
2.1 RT- P CR 检测方法的建立及反应条件的优化 4
2.2 特异性实验结果 4
2.3 敏感性实验结果 5
2.4 可靠性检测结果 5
2.5 临床样品检测结果 5
2.6 Sapelovirus cDNA全长测序及分析结果7
2.6.1 基因核苷酸序列及推导的氨基酸同源性分析 8
2.6.2基因亲缘关系分析 9
3 讨论10
致谢 11
参考文献 12
猪萨佩罗病毒 RT-PCR 检测方法的建立与应用及基因组序列测定与分析
引言：猪萨佩罗病毒(Porcine Sapelovirus, PSV) 临床上可以造成包括猪的脑脊髓灰质炎、肠道炎、肺部炎症、生殖器官疾病等多众疾病在内的多系统综合征，于上世纪由英国科学家分离自腹泻猪的粪便样本，随后在中国、巴西、西班牙、英国、韩国等其它国家相继发现并报道。根据目前的调查可知，萨佩罗病毒属分为禽萨佩罗病毒(之前被称为鸭小RNA病毒TW90A)、萨佩罗病毒A (PSV-1)和萨佩罗病毒B (之前被称为猿萨佩罗病毒)[3]，而我们实验室所检测的猪萨佩罗病毒是归属于萨佩罗病毒A 的。我国的第一例猪萨佩罗病毒是由LAN等在某爆发猪脑脊髓炎的猪场首次分离并测序的。分析随后的流行病学调查我们可以看到：猪萨佩罗病毒在我国猪群中是广泛存在的而且具有一定的感染率。尽管在人类中还未检测到萨佩罗病毒目前，但在猪、鸟类、灵长类动物、海狮以及老鼠中已经发现了该病毒的存在。根据在华东、华南、西南等地区的猪场开展的流行病学调查，我们可以看到猪萨佩罗病毒在我国的猪场中有一定的阳性率。其中，华东地区猪萨佩罗病毒的阳性率为17.2%，华南地区的检出率为18.21%，四川地区较高，达到20.4%[4]。因此，本实验根据已经发表的中国地区猪萨佩罗病毒基因序列设计并合成一对上下游引物，建立了一种新引物检测猪萨佩罗病毒的RT-PCR 方法。结果显示该引物能够敏感的、快速有效的且特异的检测出临床样品中的猪萨佩罗病毒，为猪萨佩罗病毒的流行病学调查提供了一种较为有效的检测方法，并且对预测和防控猪萨佩罗病毒的传播具有重要意义[5]。
根据文献总结分析，当前关于猪萨佩罗病毒的研究还主要集中在其流行病学调查及分析。迄今为止，国内外尚未见关于猪萨佩罗病毒入侵方式与途径、感染宿主范围、病毒的变异与迁移、免疫与致病、细胞和组织嗜性、暴发与流行、跨种间感染与传播等机制的研究报道[6]。尽管关于猪萨佩罗病毒的识别位点已有初步研究，但关于猪萨佩罗病毒的受体的特异性进化以及对其致病性和基因靶向性的影响，还有猪萨佩罗病毒急性感染时的暴发流行、隐性感染时的亚临床症状等相关致病机理研究在国内外还仍未开展和深入。因此，能够准确检测实验室分离得到的PSV全序列将会为萨佩罗病毒的进一步研究提非常重要的基础。此外，灵长类猿源萨佩罗病毒[7]的报道引发了猪萨佩罗病毒是否存在潜在跨种间传播感染的可能性的讨论，这亟待我们通过进一步深入分析中国地区的猪萨佩罗病毒与其他类型的萨佩罗病毒（如禽萨佩罗病毒）的亲缘关系。
1 材料与方法
1.1主要实验材料
1.1.1 病料样品 猪萨佩罗病毒样品由本实验室于2015 年从江苏省某发生腹泻的猪场中确诊并分离；TGEV（猪传染性胃肠炎病毒），PRV（猪伪狂犬病病毒），PRRSV （猪繁殖呼吸综合征病毒），PCV（猪圆环病毒），PEDV（猪流行性腹泻病毒），CSFV（猪瘟病毒）和PSV（猪萨佩罗病毒）均由本实验室分离鉴定；含有实验室分离的猪萨佩罗病毒毒株（PSV-JS2106）吹冰段不同的基因序列的重组质粒由本实验室构建；大肠杆菌DH5α 由本实验室提供。临床待检样品分离自以江苏省为中心，包含河北、四川和北京等地的病猪，共345 份，样品包括：来自不同猪场的提取物（如肠道、粪便、组织、血清、淋巴和肺脏等）和粪便拭子等。
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