猪萨佩罗病毒RT-PCR检测方法的建立与应用及基因组序列测定与分析(3)
1.1.2 培养基及抗生素配制 TSB(Tryptie soy Broth)（MERCK公司）液体培养基：6gTSB粉末溶于180mL水中，115oC高压蒸气灭菌20min。使用时加入终溶度为10ug/mL的NAD（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸/ Nicotinamide adenine dinucleotide）（国药化学试剂）和10%小牛血清（国药化学试剂）。
TSB(Tryptie soy Broth)(MERCK公司)固体培养基：6gTSB粉末溶于180mL水中，加入1.5%的琼脂粉，115℃高压蒸气灭菌20min。等到温度冷却为50℃时加入NAD使其终浓度为10ug/mL并加入10%的小牛血清，在通风橱中倒平板，等到培养基凝固后，保存于4℃。
LB液体培养基：5gLB粉末溶于200ml水中，加入1.5%的琼脂粉，115℃高压蒸汽灭菌20min。使用时加入终浓度为100mg/ml的Amp。待温度降至约50℃时加入终溶度为100mg/ml的Amp，铺制平板，待培养基凝固后，于4℃保存备用。
氨节青霉素(Amp，南京天为生物有限公司)：用灭菌ddH2O配成贮存浓度50mg/mL，一20℃备用[8]。
1.1.3主要试剂 核酸(RNA/DNA)提取试剂盒以及RT-PCR Mix 和反转录试剂盒购自思普金生物科技有限公司（南京）；dNTP、DL2000 DNA Marker、pMD19-T 载体购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 引物的设计与合成
引物的设计与合成根据PubMed中已有测序的猪萨佩罗病毒的基因序列，利用DNAStar 和Primer5.0软件设计扩增的特异性上下游引物：ACCAGGGTGCTATAATTGTTGCT; CGTACATTTGTGCTAATCGGGAC预计扩增片段长度为675 bp。引物由思普金生物科技有限公司合成（南京）。
1.3 病料样品的处理及模板的制备
将感染不同病原的临床组织病料样品加入PBS 缓冲液进行充分的研磨并反复冻融（3次），离心后取上清液弃去下层沉淀，提取病毒总RNA（参照RNA提取试剂盒说明书）， 并制备cDNA（利用反转录试剂盒），保存备用。
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