磁性纳米材料固定化微杆菌细胞的研究(8)
3.2.3 酶活测定
测定每次发酵液OD值，并根据OD-DCW公式换算，取一定量发酵液使最终干细胞重为4mg, 离心(40℃, 8000rpm, 5min)弃上清液，并以0.80% NaCl溶液洗涤离心(4℃, 6000 rpm, 5min)2次。所得菌体以950 μL 磷酸盐缓冲液(0.2 M, pH 8.0)重新悬浮，加入50 μL二酸二酯/DMSO溶液，使反应体系中二酸二酯/DMSO溶液最终浓度为10 mM，涡旋振荡，反应条件为180 rpm, 30℃, 30min。反应结束用涡旋振荡后取300 μL，加入600 μL甲醇中，混匀后离心(常温, 12000 rpm, 10min)，取上清液膜过滤，高效液相色谱法分析。
一个酶活单位(U)定义为：30℃下，每min催化生成1 mol单甲酯所需要的酶量。
HPLC条件：流动相为甲醇和蒸馏水，体积比65：35(v/v，磷酸调pH至2.5左右），流速为1.0 ml/min，检测波长为210nm，流速1.0 ml/minb，伊力特C18柱。
4 实验结果与讨论
4.1磁性Fe3O4/CS纳米颗粒的表征
4.1.1磁性Fe3O4 /CS纳米颗粒的红外光谱分析(FTIR)
图1.3为磁性Fe3O4 /CS纳米颗粒的红外谱图。根据文献可知，500 cm-1有Fe的特征吸收峰，是由Fe-O粒子的振动引起的。图4.1中在566.55 cm-1的特征吸收峰证实了材料中存在着Fe3O4材料。而在3439.5 cm-1处的则是壳聚糖的特征吸收峰，该吸收峰是由于-NH2和-OH的伸缩振动；1450.47 cm-1处的吸收峰归因于C-O的振动吸收，而1380.47 cm-1处是CH3的C-H带来的变形振动峰，这是由于壳聚糖没有完全脱乙酰基所致。另外在磁性Fe3O4 /CS纳米颗粒的红外图谱中，在1639.5 cm-1处有一个较强的Schiff碱的特征吸收峰，这是由C=N基团的伸展振动引起的，这也表明在戊二醛和-NH2之间发生了反应，壳聚糖和磁性Fe3O4材料之间发生了化学作用，形成了Fe3O4 /CS颗粒。
磁性Fe3O4 /CS纳米颗粒的是在在超声作用下，将磁流体完全分散，并呈现纳米尺度状态分散于液体石蜡溶液中，并含有表面活性剂Span-80，从而形成油包水的微乳液体系，使得Fe3O4粒子得以均匀地分散于反应介质体系，在交联剂戊二醛的作用下壳聚糖单体吸附于Fe3O4粒子的表面，包裹形成壳聚糖壳层。
图4.1 磁性Fe3O4 /CS纳米颗粒的红外谱图
4.1.2 磁性Fe3O4 /CS纳米颗粒的X射线衍射
图4.2所示为磁性Fe3O4 (a)和磁性Fe3O4 /CS颗粒(b)的XRD谱，和标准衍射粉末卡片比较发现没有其他杂质晶体峰的出现，为单一相的Fe3O4。由图4.2（b）可知，Fe3O4粒子的衍射峰的位置和磁性壳聚糖纳米粒子的主要衍射峰的位置一致，这说明包裹壳聚糖以后，并未显著影响Fe3O4晶体结构，而呈现出同样的尖晶结构。在15°~20°内，存在的非晶相峰可能是由于磁性Fe3O4颗粒表面包被了非晶相的壳聚糖。
图4.2 磁性Fe3O4（a）及磁性Fe3O4 /CS（b)纳米颗粒XRD谱
4.1.3 磁性壳聚糖Fe3O4纳米颗粒扫描电镜图(SEM)
图4.3 巧克力微杆菌电镜SEM图(a)；磁性Fe3O4/CS纳米颗粒SEM图(b)；磁性Fe3O4/CS纳米材料吸附细胞SEM图(c)
图4.3(a)为巧克力微杆菌电镜SEM图，图4.3 (b)磁性Fe3O4/CS纳米颗粒的SEM图，可以看到磁性纳米材料的颗粒比较均匀，颗粒大小在300nm左右，有一定程度的团聚，这可能是由于粒子在制备分离过程中采用了磁场分离，使得粒子产生一定程度的磁化造成了粒子团聚; 图4.3 (c)磁性Fe3O4/CS纳米材料吸附细胞SEM图，显示在微杆菌细胞的周围被磁性Fe3O4/CS纳米材料所包围，从而牢固的被固定了。
4.1.4 磁性Fe3O4/CS纳米颗粒的磁滞回线
图4.4是磁性Fe3O4和磁性Fe3O4 /CS颗粒的磁滞回线。由图可以看出两者的磁滞回线的可逆矫顽力接近零，表明所得四氧化三铁颗粒和壳聚糖包裹的磁性粒子都具备超顺磁性，对粒子的磁搅拌和磁分离有利，可用于做固定化细胞的载体。未包裹的磁性Fe3O4的比饱和磁化强度为71.64 emu/g，壳聚糖包裹的磁性粒子的比饱和磁化强度为51.67 emu/g。与改性前相比有所降低，这是由于壳聚糖的壳层将Fe3O4包裹后，影响了Fe3O4的磁性。