猪源沙门氏菌噬菌体的分离及生物学特性测定(2)
1材料与方法
沙门氏菌A9，A21，C71，C121，B50，B60，D134，D138，G4，E113，菌株由本实验室临床分离；大肠杆菌MG1655、DE205B由本实验室保存；沙门氏菌YZ-CY，YZ-AGN，YZ-YDAN，YZ-Y，YZ-JBL菌株由扬州大学实验室馈赠。Yeast Extract干粉、Tryptone、Agar干粉菌购自OXOID公司。
粪便、污水样品于2016年采集于安徽马鞍山、安徽滁州、江苏镇江、江苏宿迁的养殖场，采集后置于4℃采样箱内保存，4 h内带回实验室。
本实验所采用的分光光度计购自Biospectrometer公司，Legend Micro 17R离心机购自thermo公司，恒温水浴锅购自北京东方精瑞科技发展有限公司，Millex-GP针头式过滤器购自Millipore公司。
1．2 方法
1．2．1 噬菌体的分离和纯化 将临床采取的粪便、污水等样品溶解于PBS缓冲液，充分混匀后10000rpm离心10min，取上清液，重复三次；分别用0.44μm和0.22μm滤器过滤，滤液4℃保存。半固体培养基加热融化后置于50℃水浴锅中待用。培养至对数期的指示菌与样品液1:1混合后吸取混合液200μL加入5mL半固体培养基中，轻轻颠倒混匀，倾倒于LB固体平板上，注意避免产生气泡。静置30min后倒置于37℃温箱培养5~6 h后观察双层平板上噬菌斑的生长情况。
选取相对直径较大、透明程度较高的噬菌斑，用小枪头点取平板上的噬菌斑，溶解于SM缓冲液。将该悬液倍比稀释至合适浓度，再同上述方法铺于双层平板，培养后挑取单个噬菌斑。反复纯化三代至噬菌斑大小均一。用纯化后的高浓度噬菌体悬液铺双层平板，待噬菌斑长满平板后，缓慢加入5mL4℃预冷的SM缓冲液覆盖平板表面，将平板用封口膜密封，放在4℃脱色摇床上20~30rpm转动孵育，4h后收集平板上的液体，用0.22 μm滤器过滤后4℃保存。
1.2.2 噬菌谱的测定 参照江艳华等人[9]的方法，选取不同来源、不同血清型的沙门氏菌菌株作为指示菌。用灭菌棉签将菌液均匀涂布于LB平板。静置约10min后，将噬菌体悬液滴加4.5μL于平板表面，并滴加4.5μL的SM缓冲液作为阴性对照。37℃培养4h后，观察记录裂解情况。
1.2.3 噬菌体效价的测定 将纯化后噬菌体悬液用4℃预冷的SM缓冲液做10倍比稀释，将10-5，10-6，10-7，10-8稀释度的噬菌体悬液分别于培养至对数期的宿主菌液1:1混合，吹打混匀，再取该混合液200μL铺双层平板。37℃温箱培养5~6h后，取噬菌斑在30~300个之间的平板计数，计算噬菌体原液效价。试验设置三个平行。噬菌体效价（PFU/mL）=平均噬菌斑个数&pide;稀释度。
1.2.4 最佳感染复数（MOI）的测定 感染复数（Multiplicity of infection，MOI）是指噬菌体感染宿主细菌时噬菌体数量与宿主细菌数量的初始比值。参照江艳华等人[9]的方法，将宿主菌培养至对数期，分别按1:1000、1:100、1:10、1:1、10:1、100:1的MOI加入噬菌体和宿主菌，并设置不加噬菌体的宿主菌菌液为对照。37℃180rpm振荡培养3.5h后取出，4℃10000rpm离心10min，取上清液测定噬菌体效价，效价最高者为最佳MOI。试验重复三次。
1.2.5 酸碱耐受性试验 参照江艳华等人[9]的方法，将0.9%NaCl溶液用盐酸或NaOH溶液调节pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。分别用不同pH值的0.9%NaCl溶液稀释噬菌体悬液至1×106PFU/mL。
将pH值得稀释液置于37℃水浴锅孵育1h后，用SM缓冲液10倍比稀释三次停止反应，将各个不同pH值不同稀释度的稀释液分别铺三块双层平板，37℃温箱培养4~5h后计数。试验重复三次，结果取平均数。