表达传染性法氏囊病毒VP2和法氏囊素三肽嵌合基因重组火鸡疱疹病毒的构建(2)
传染性法氏囊病病毒（IBDV）是双股RNA病毒科（Birnaviridae），双股RNA病毒属。该病毒的基因组被分为两个大小不同的基因片段，比较大的片段为A片段，较小的片段为B片段。IBDV拥有有五种病毒蛋白，分别是：VP1（分子量为90-92KD）、VP2（疯子量大概为41-48KD）、VP3（分子量大概是32KD）、VP4（分子量大约为28-32KD）和VP5（暂且没有研究得到结果）。我们研究得到B片段编码的蛋白主要就是VP1；由A片段编码而成的蛋白是另外四种病毒蛋白，主要是A片段编码的多聚蛋白加工形成；在它编码而成的病毒蛋白当中，VP2和VP3是构成病毒的主要结构蛋白，IBDV的病毒衣壳主要蛋白就是VP2和VP3，根据研究表明VP4是病毒自身的蛋白酶之一，目前来说VP5还没有做具体研究，它的功能暂且还不清楚。经过研究，VP2是病毒的主要结构蛋白之一，是病毒的主要保护性抗原，研究表明VP2上有主要已经鉴定出来的中和表位，并且这些中和表位都具有构象依赖性的特点[3-5]，它是研究IBD基因工程疫苗首选靶基因[6-11]。
法氏囊(Bursa of Fabricius, BF)是禽类非常特别的一个结构，别的种类的动物都没有，它是一种免疫器官，它能够为B淋巴细胞的生长、发育、成熟提供了非常好的微环境，使B淋巴细胞更好的发育、成熟，同时它还是免疫球蛋白基因转变场所。三肽囊素(Bursin, BS)，是一种化学物质，是禽类法氏囊分泌的一种免疫活性物质，它能诱导家禽和哺乳动物B细胞前体分化及免疫器官的成熟；其靶器官是BF，能够拮抗IBD疫苗对BF是有一定的损伤的，而BS能够保护靶器官BF，拮抗疫苗对他的损伤，从而提高了ND的弱毒疫苗和油苗产生抗体水平[12-13]。所以本实验我们采用的免疫增强作用的物质为BS。
火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)是一种a疱疹病毒，根据多年来的科研研究证明，HVT普遍的使用在1日龄雏鸡的免疫，可以预防马立克氏病(MD)。HVT病毒的基因组非常大，可以容纳多种外源基因。我们将HVT和其他病毒载体做了一些比较，发现它具备了很多独特的优势：(1)HVT疫苗的生产、储存和接种等方面都拥有十分成熟的方法。(2)HVT对鸡没有任何副作用，不会造成任何伤害，使用极为安全。(3)HVT接种鸡后，其疫苗毒可以再鸡体内很长时间的发生反应，有的甚至长达数周，这样HTV就可以长时间的去刺激机体从而是机体产生免疫反应，达到我们想要的非常理想的免疫保护效果。(4)HVT可以在鸡胚成纤文细胞（CEF）上迅速生产、繁殖，从而生产出非常多的病毒，并且都带有囊膜，如此一来，我们就可以将这些好的病毒提取出来，并且大量制备冻干疫苗，然后将其放在4℃冰箱内长期保存，等我们需要的时候拿出来还可以正常使用，非常方便。(5)HVT一般情况下不会发生水平传播，更甚至在鸡群非常密集的区域，也不会发生，所以我们用它做的重组疫苗散毒的可能性非常低，很安全。（6）HVT的自然宿主非常的局限，它只会寄生于禽类，对家畜和人类都非常的安全的。因此以HVT为载体的基因工程疫苗一直是国内外学者研究的热点[12-15]。三肽囊素(Bursin, BS)是禽法氏囊免疫活性物质。在三肽囊素对畜禽的免疫增强作用的基础上，本研究以HVT FC126 基因组的非必需区UL55～LORF4为插入位点，以Pec启动子(经过修饰的鸡β肌动蛋白启动子)构建表达IBDV VP2嵌合法氏10拷贝囊素三肽（BS10）基因的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-pec-BS10-VP2)，并对其生物学特性进行初步研究，为IBD重组火鸡疱疹病毒基因工程疫苗的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
pMD19-T simple vector主要选购于宝生物工程（大连）有限公司；AxyPrep质粒小量纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒主要在Axygen购买获得，X-gal、IPTG、限制性核酸内切酶、T4 DNA Ligase、ATP、dNTP及Taq DNA聚合酶都是在宝生物工程（大连）有限公司购买的；DMEM培养基从Invitrogen公司购得；胰酶购自Thermo公司。质粒pMD-gpt、鸡抗IBDV单克隆抗体、吹冰根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体这些都是在本实验室里由实验者实验制备；DAB显色试剂盒是在武汉博士德公司购买的。