传染性法氏囊病病毒（IBDV）结构蛋白VP3及其突变体的表达纯化(2)
3讨论18
致谢19
参考文献19
传染性法氏囊病病毒（IBDV）结构蛋白VP3及其突变体表达纯化
引言：传染性法氏囊病（Infectious bursal disease）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的，多发于3-6周龄雏鸡的一种急性传染病且同时具有高度接触性、易扩散的特征。该病的发病部位主要在雏鸡的中枢免疫器官―法氏囊，造成免疫抑制[1]。并可诱发多种疾病或使多种疫苗免疫失败[2]。发病后会出现如下主要临床症状：腹泻、颤抖、极度虚弱乃至死亡。法氏囊是禽类的中枢免疫器官，在禽类的免疫应答过程中起着重要的作用，当受到抗原刺激时，法氏囊会刺激B淋巴细胞使其产生特异性抗体，进而来完成机体的免疫应答过程，对机体起到免疫保护作用。而IBDV主要侵蚀鸡法氏囊，幼鸡感染后，会导致免疫抑制诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败。故本病对养禽业危害重大，是国际公认的鸡的三大疫病之一[3] 。
传染性法氏囊病毒（IBDV）由五种蛋白质构成，即：VP1、VP2、VP3、VP4和VP5[3,4]。其中VP3和VP2共同形成病毒的核衣壳，二者约占到IBDV蛋白比例的90%以上，因此VP2和VP3是IBDV的主要结构蛋白。IBDV的抗原表位主要存在于VP2蛋白上，VP3蛋白上也存在一些线性表位，可诱导具有中和病毒活性的中和抗体产生。所以VP2蛋白和VP3蛋白对IBDV的抗原性起着决定性的作用。
VP3羧基端含有较多的Proline和碱性氨基酸,与病毒蛋白VP1以及病毒基因组dsRNA相互作用并参与病毒的复制、组装、成熟,同时还有稳定病毒基因组dsRNA的作用[5]。为了更好的开展VP3相关实验，获得有活性的VP3蛋白，本研究旨在表达、纯化得到VP3蛋白，同时还对VP3截短体进行了表达纯化，由于IBDV在复制过程中，VP1-VP3组成IBDV的复制中心，已有文献报道，VP3的C末端16个氨基酸及负责和VP1相互结合[6]。本研究同时还表达纯化了，His-VP3(patch)，His-VP3(KR),His-VP3△16。
本次试验大体分为以下几个部分:
1.初步分析His-VP3的表达方式及表达量；2.摸索VP3最佳表达条件：从表达时间、IPTG浓度梯度两个方面进行实验；3.大量表达并非变性纯化His-VP3；4.大量诱导并纯化VP3突变体蛋白，His-VP3(patch)，His-VP3(KR), His-VP3△16。
1 材料和方法
1．1 材料
1.1.1 重组质粒及重组表达菌
pET-28a VP3重组质粒、pET-28a VP3△16、BL21（DE3）pLySS、His-VP3(patch)、His-VP3(KR)、His-VP3△16。重组表达菌均保存于南京农业大免疫研究所。
1.1.2 表达菌株
BL21（DE3）pLySS表达菌株保存于南京农业大学免疫研究所。BL21（DE3）pLySS感受态细胞由75mM CaCl2低渗、低温处理，透化细胞壁制作而成，方便外源DNA进入工程菌。
1.1.3 PCR菌液鉴定所用试剂及缓冲液
胶回收试剂盒、PCR扩增酶、DNA marker、LB培养基、琼脂糖、琼脂粉，50×TAE电泳缓冲液等。部分试剂具体配制方法列于下方表1、表2。
表1 5*TBE储存液
试剂名称 Tris-Base 硼酸 EDTANa2
用量 54.0g 27.5g 3.72
蒸馏水溶解定容至1L，核酸电泳配制核酸胶时或作为电泳液使用时稀释100倍
表2 LB培养基
试剂名称 Tryptone Yeast Extract NaCl
用量 10g 5g 10g
蒸馏水溶解定容至1L高压灭菌备用，固体LB，每100 mL液体LB中添加1.2g 琼脂粉，溶解高压灭菌少量置于灭菌平板中冷却凝固备用，如需添加卡那抗性，按照1:1000的比例添加卡那抗性。
1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂