蚂蟥Hirudin基因克隆及吸食对其表达的研究(2)
节肢动物虽小,但吸食过程同样要在中枢神经系统统一支配下经内外感受器和神经
反馈环的共同调节来完成，蚂蟥吸食过程经由唾液腺到嗉囊，再到肠，研究发现水蛭素大多在于水蛭的新鲜唾液腺中，而且含量甚微，因此水蛭素的基因重组技术的研究也取得了一定进展[5]，但效果尚不理想。目前为止，鲜见蚂蟥以及其他非吸血蛭水蛭素基因的研究报道，本实验拟通过克隆蚂蟥水蛭素基因（Hirudin），同时研究吸食对水蛭素基因表达的影响，为蚂蟥水蛭素基因的研究提供参考资料。
1 材料
1.1动物
蚂蟥由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；螺蛳（采自南京前湖，野生）经郭巧生教授鉴定为梨形环棱螺Bellamya purificata Heude，在投喂过程中，取吸食后停止投喂的第1，3，5，7，11天的9条蚂蟥的唾液腺，嗉囊和肠-80℃保存备用，用于抗凝基因时空表达研究。
1.2菌株及载体
大肠杆菌感受态、pMD18-T载体购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
1.3仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC-200，bio-RAD）,电泳仪（DYY-6C，北京吹冰一仪器厂）；凝胶成像仪（JS-380，上海培清科技有限公司）。Trizol RNA 抽提试剂、SYBR Green mixture、PrimeScript TR Master Mix、TaqDNA 聚合酶、dNTP、DNA 标准品( DL2000) 均购自 TaKaRa 公司; 胶回收试剂盒和八联管为美国 Axygen 公司产品。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
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