塑化剂对猪卵子质量的毒性作用研究(2)
邻苯二甲酸二（2-乙基）己基酯(DEHP)是存在于塑化剂中主要的有毒物质，可经过皮肤、肺和胃肠道被机体吸收，胃肠道是目前通常认为的主要吸收途径。通过食物摄入少许DEHP(0.64mg/kg)时，DEHP在人体内吸收和分布的时期可持续约4-8h[3]。DEHP进入机体之后，在胰腺酶和肠道内的一些酶的作用下，转变为以邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯(MEHP)为主的单酯。因此在肺脏、肝脏、胰腺、睾丸、肾脏和血液中DEHP都可以被水解为MEHP，部分的DEHP会在24h内经由汗液、尿液或者粪便从体内排出，而MEHP作为其主要代谢产物则会长期蓄积在人体的组织中，生物蓄积时间可长达6个月[4]。
DEHP具有很多潜在的慢性毒性，目前已通过体外细胞实验、动物实验（主要是啮齿动物）等调查方法，证明了DEHP可能引起细胞代谢紊乱、可能造成心血管系统障碍、病毒性肝病、肾功能衰竭，甚至可能致癌[5]。
塑化剂对于家畜家禽的生殖系统有着一定的不良影响。用电镜观察HE染色后的大鼠睾丸，在处理组中发现各级生精细胞产生大量的缺失，生精小管发生严重萎缩，间质细胞异常增生，支持细胞呈空泡状，细胞结构紊乱，未见精细胞，细胞核体积较大，核凹陷严重形状异常，核膜处产生切迹、不光滑，且在核膜下有核异染色质附着，细胞器数量降低，线粒体增多且形态发生改变，细胞出病变。这些结果表明，DEHP可以通过影响睾丸的超微结构来影响睾丸的正常生长，从而影响大鼠的生殖毒性[6]。
关于雌性生殖系统，已有实验证明，2000mg/kg 的DEHP可以减少大鼠雌二醇的合成，改变自然排卵周期发生，延长动情周期，并且产生不排卵的现象，同时卵泡的体积减小，并出现多囊卵巢[7]。体外培养SD大鼠卵泡实验发现，随着升高MEHP的剂量，卵泡发生轮廓不清，内部产生黑色坏死区，卵泡基底膜出现缺失、模糊不清，卵子逸出的现象[8]。MEHP浓度为80 μg/ml时可明显地抑制囊状卵泡的生长与发育[9]。100 μg/ml 的MEHP则可增加卵巢颗粒细胞的凋亡数量，降低卵泡存活率[10]。同时也可使小鼠的闭锁卵泡数提升[11]。添加雌二醇与含DEHP和MEHP 的培养液进行共同培养，可以使DEHP和MEHP对卵泡生长的抑制作用得到一定的拮抗[12]。
然而，有关塑化剂对于猪卵母细胞的危害研究还较少。本课题利用MEHP对猪卵子进行体外培养，检测卵子的颗粒细胞扩散情况、极体排出率、氧化应激水平以及早期凋亡情况，进而总结出塑化剂对于卵子质量的毒性作用。
1 材料与方法
1．1 抗体和试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG)：宁波市第二激素厂，Lot.No：091103
人绒毛膜促性腺激素(hCG)：宁波市第二激素厂，Lot.No：111215
L-半胱氨酸(cysteine)：美国Sigma-Aldrich公司，Cat.No：C7880
表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)：美国Sigma-Aldrich公司，Cat.No：E5160
青霉素钾(penicillin)：山东鲁抗医药股份有限公司，LotNo：S090615
葡萄糖(D-glucose)：美国Sigma-Aldrich公司，Cat.No：G7021
二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)：Sigma-Aldrich公司，Cat.No：D2650
组织培养基TCM-199：美国Sigma-Aldrich公司，Cat.No：M-2154
杜氏磷酸盐缓冲液(PBS/DPBS)：美国Life Technologies公司，Cat.No：SH30028.01B
透明质酸酶(hyaluronidase)：美国Sigma-Aldrich公司，Cat.No：H-3506
石蜡油：美国Sigma-Aldrich公司，Cat.No：M8410
羊毛脂(lanolin)：国药集团化学试剂有限公司，Cat.No：69014628
活性氧试剂盒：南京建成生物工程研究所，Cat.No：E004
Annexin V-FITC 早期凋亡试剂盒：南京诺唯赞生物科技有限公司，Cat.No：A211-01/02