重组腈水解酶产生菌的发酵产酶及其催化性能研究(2)
表3.1 碳源种类对生长及酶活的影响 11
3.1.2碳源浓度对生长及酶活的影响 11
3.2氮源优化 12
3.2.1氮源种类对生长及酶活的影响 12
3.2.2氮源浓度对生长及酶活的影响 13
3.3金属离子对生长及酶活的影响 14
3.4诱导条件对生长及酶活的影响 14
3.5初始pH值对生长及酶活的影响 15
3.6温度对生长及酶活的影响 16
4 结论 18
致谢 19
参考文献 20
1 研究背景
1.1 腈水解酶简介
腈水解酶最先是由Thiman和Mahadevan在1964年时从大麦叶中分离出来，能够将吲哚乙腈水解成为吲哚乙酸，故将其命名为吲哚乙腈水解酶。但是在后来的研究中发现，该纯酶对26种不同的腈化合物均具有活性，它水解3-氰基吡啶的活力是吲哚乙腈的8倍。因此Thiman和Mahadevan将其命名为腈水解酶[1]。
腈类化合物是一类含有氰基官能团的化学物质,可以用于合成各种羧酸和酰胺的重要化工原料[2-5]，也是药品和精细化工生产中的重要中间体。腈类化学水解通常需要强酸或碱性条件和较高的反应温度，通常产生有害副产品。与此相比，腈水解酶介导的腈类水解成羧酸有着高产率和高选择性的转换可获得极好的工业利益[6,7],由于这样的转化在温和条件下且不会改变其他不稳定的活性基团。在这方面，从各种微生物获得的腈水解酶（EC3.5.5.1）和其在生产烟碱酸，布洛芬，丙烯酸和氰化物废料的解毒应用被报道过[8,9]。尽管腈水解酶可提供巨大的合成潜力，由于其稳定性差，低选择性，工业应用腈水解酶作为生物催化剂大部分未开发。这些阻止了腈水解酶在工业上应用，因此，寻找新的和有前景的腈水解酶是必要的。
1.2 产腈水解酶的微生物
腈酶的发现已经有40多年的历史，第一个可以产腈水解酶的微生物菌种是由Hook和Robinson利用天然腈化合物蓖麻碱作为唯一碳源筛选得到的假单孢菌(seudononas)，该菌水解氰基吡啶的能力比蓖麻碱高1.18倍[9] 。起初有人观察到在植物中睛酶可以转化吲哚-3-乙腈生成吲哚-3-乙酸，在此之后，很多研究者筛选到了一系列可以产腈水解酶的微生物，而这正是通过特定的腈化合物作为唯一碳源或者氮源，同时还在一些植物中也提取出腈酶，其中有一些具有优良腈水解酶活力的代表性细菌、真菌和植物如敏捷食酸菌、无色杆菌属、放射性土壤杆菌、反硝化产碱菌、白被芽孢杆菌、荧光假单胞菌、马红球菌、尖孢镰刀菌、黑曲霉等，这些微生物可以代谢很多天然和人工合成的腈类物质。
1.3 腈水解酶的作用机理
腈水解酶可以直接催化腈类化合物水解，一步生成相应的羧酸及氨。若是腈通过腈水合酶(nitrile hydrolase, EC 4.2.1.84)和腈酰胺酶(amidase, EC 3.5.1.4)共同参与进行水解转化，则先生成相应酰胺，然后再将酰胺转化成相应的羧酸 [10]。通常情况下，采用前者进行水解的是芳香族以及环腈，而脂肪族的腈则是采用后者的方式水解。腈水合酶和腈水解酶为腈的水合或水解带来了独有的途径。有时在极端微生物中，腈酶也可以表现出腈水合酶的活性，而且这些腈酶还具有优良的稳定性。
值得注意的是，腈水解酶在以腈为底物的反应中并不催化产生相应的酞胺[11]，也就是说，由酶分子中巯基介导的催化反应产生酸的同时并不带来共价结合的酞胺[12]。我们通过研究腈水解酶分子催化中心的3D模拟以及染色体组而对腈水解酶的作用机理有了更为深刻的了解[13]。首先腈水解酶中保守的半肤氨酸残基对碳原子进行亲核攻击，与第一个水分子加成后产生氨，而后再与第二个水分子进行取代反应生成相应的羧酸，同时腈水解酶得到再生 [14]。
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