小鼠大脑小脑的组织学研究(2)
1.材料与方法1.1材料1.1.1 实验动物健康成年雄性小鼠，体重在 80~100g 范围，由上海实验动物中心提供。饲养室温20~24℃，相对湿度 45%~55%，通风状况良好，12h 昼夜节律，并定期更换垫料。
1.1.2 试剂多聚甲醛、无水乙醇（100%）、二甲苯、苏木精-伊红染液（新制备）、石蜡、中性树胶、2%醋酸双氧铀、柠檬酸铅(试剂购自南京农业大学后勤保障部)等。
1.1.3 仪器设备EG1150 石蜡包埋机、RM2245轮转式切片机（Lesica 公司，德国）、LEICA RM225轮转式切片机、 恒温水浴锅、 熔蜡箱、 OLYMPUS CS21FSI 光学显微镜、 电子显微镜、 YM200摄像机（武汉力拓科技有限公司）等。1.2方法1.2.1 制作脑组织石蜡切片1.2.1.1 取材与固定首先将小鼠脊髓拉断致死后，固定在解剖台上，随后立即断头并仔细分离出脑组织，接着分别将大脑和小脑组织放入盛有 4℃、4%多聚甲醛的标本瓶中 1~2h，组织块适度硬化后， 对标本进行修整， 体积大小约为 （1.0×1.0×0.5） cm3， 最后继续置于4℃冰箱中固定 24h。
1.2.1.2 脱水与透明将组织块需要的切面向下置于塑料脱水包埋盒中，室温（25℃）下进行乙醇梯度脱水，二甲苯透明。 具体操作如下： 75% 酒精 3h 85% 酒精 1h 95% 酒精Ⅰ， 1h 95% 酒精Ⅱ，1h 100% 酒精Ⅰ45min 100% 酒精Ⅱ，45min 二甲苯透明 1min 30s。1.2.1.3 浸蜡与包埋打开熔蜡箱，在熔蜡箱内将组织浸苯蜡（苯：蜡=1:3）1min，温度58~60℃，之后浸全蜡温度 60℃，时间为 2h；包埋时先向模具内倒入一定蜡液，再保持切面向下放入组织块，组织块之间要保持一定距离，避免产生气泡；若有气泡，可用热镊子除气泡。关熔蜡箱。等待蜡块冷却成型。1.2.1.4 切片切片之前，将蜡块修整，不宜修得太小。然后将蜡块夹在轮转式切片机的固定器上就可以进行切片。与此同时要将恒温水浴锅内的水升温至 42℃，展片备用。在旋转式切片机上先按 18μm 厚度切蜡块，待切到组织时换刀片，将组织厚度设置换为 6μm，进行切片；用毛笔笔头小心卷下组织蜡带，将 3-5个相连组织蜡片切下，用镊子轻轻夹起边角慢慢放入 42℃水浴锅中展片，避免出现褶皱，如有褶皱，可用镊子小心展平，但动作要尽量轻柔，以免撕裂组织。然后用干净的铅笔标记过的载玻片缓慢捞起组织，使组织尽量铺展在玻片中央。将玻片放在玻片架于温箱中烘干。烤片前先将玻片架放置约 15～30 min，使玻片晾干至无明显水珠附着，然后再置于烤片机中，烤片机温度设置为 65 ℃，烤片时间约 1 h。1.2.1.5 脱蜡与脱苯脱蜡的工序： 二甲苯 5min； 二甲苯Ⅰ5min。 玻片上的石蜡经过三缸二甲苯次序性溶解，最终得以清除而保留有用组织。脱蜡完成后， 需经过 100%酒精 2min 95%酒精 2min 85%酒精2min 75%酒精2min 进行脱苯；最后进行水洗，即在双蒸水中浸泡 2min。
1.2.1.6 苏木精-伊红染色与封片染色的目的是使组织细胞不同的结构呈现不同颜色，便于在显微镜下观察。苏木精为碱性染料，可使细胞核呈现蓝色；伊红为酸性染料，可使细胞质呈现浅粉红色。在光学显微镜下可以清晰的观察到明显的蓝色胞核和粉红色的细胞质。组织和细胞中的酸性物质与苏木精亲和力强，易被染成蓝色的特性成为嗜碱性；碱性物质与伊红染液有较强亲和力，且易被染成深浅不同的红色的特性，被称为嗜酸性【6】。苏木精-伊红（HE）染色法：苏木精染液，4min 流水冲 5min 75%酒精，2min85%酒精，2min 伊红染液，2min 95%酒精 I，2min 95%酒精 II，2min 100%酒精 I，2min 100%酒精 II，2min 二甲苯 I，5min 二甲苯 II，5min。用吸水纸将玻片周围擦拭干净，后用中性树脂粘贴盖玻覆盖组织进行固封。在固封时组织切片上尽量不要有气泡产生，以免影响后期观察。