两种药用植物内生真菌抗动物病原细菌活性筛选(2)
E. Coli与Staphylococcus aureus是危害性较大的动物病原细菌常引发家畜疾病，其惊人的繁殖和感染能力给家畜带来大规模的伤害。E. Coli 可致使家畜腹泻，常污染水源给畜牧业的生产发展造成重大经济损失［8-9］。Staphylococcus aureus对抗生素的耐药性逐渐提高，有超级细菌之称，对人类健康事业发展带来巨大威胁，需要发现新型抗菌物质。银杏和重阳木是我国珍贵药用植物资源，从中获得能有效抑制动物病原细菌生长的高活性内生真菌，期许能从其次级代谢产物中分析提纯出能够抑制E. Coli与Staphylococcus aureus的高活性新物质，从而扩大相关治疗药物的来源。
银杏俗称白果, 是我国特有的世界珍稀名贵树种, 是冰川运动后的孑遗植物, 被称为活化石。银杏作为邳州支柱经济产业之一，其种植面积尤为广泛。银杏是中国珍稀药用植物，药用价值巨大，其衍生保健产品远销海外。重阳木又称秋枫树，落叶乔木, 树高可达15m 。树皮灰褐色, 老时呈鳞片状开裂而粗糙; 韧皮部为深褐色, 具血红色乳液, 稍脆, 略带甜［10］，是治疗风湿病的重要药材，但目前对于其内生菌的研究还未见报道。因此,我们以邳州市为重点，采集不同年龄段的银杏和江苏师范大学校园重阳木。对其利用组织块法进行内生真菌分离纯化，筛选出活性菌株并对高活性菌株做分子鉴定等初步研究。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 植物样本来源
新鲜植株重阳木采自江苏师范大学生命科学学院（CYM）；银杏采自江苏师范大学校园（YX-S）；江苏邳州市运河师范校园（YX-Y）；邳州市铁富镇银杏苗林（YX-T） 和邳州市港上银杏博园(YX-G) 。
1.1.2 培养基
（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：
马铃薯200g 、葡萄糖20g 、琼脂20g、 水1000ml 。
（2）沙氏培养基（SDA）：
蛋白胨10g 、琼脂20g 、麦芽糖40g 、水1000ml。
（3）CYM培养基：
葡萄糖20g 、酵母膏2g 、蛋白胨2g、七水硫酸镁0.5g、 磷酸氢二钾1.0g 、 磷 酸二氢钾0.46g 、琼脂20g 、水1000ml。
（4）LB固体培养基：
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L、 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 、 氯化钠(NaCl) 10g/L 、琼脂15g/L。
分离培养基为PDA、SDA、CYM。斜面种子培养基和活化培养基与相对应分离培养基相同； 摇床发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）；指示菌培养基为LB固体培养基和 LB液体培养基。
1.1.3 指示菌菌种
Escherichia coli（CVCC1490）；Staphylococcus aureus（CVCC2241）本实验室保存。
1.1.4主要药品与试剂
葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、琼脂条、95%乙醇、5%次氯酸钠、CTAB、Tris-饱和酚、 EDTA、 Tris Cl、 NaCl、 SDS、氯仿、异戊醇、琼脂糖 、ITS4引物、ITS5引物、Mark、Mix、TAE、Loading buffer、EB 。
1.2 主要仪器与设备
表1.1 仪器名称目录
Table 1.1 Name of Apparatus
名称 产地
SW-CJ-2FD型
双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司
DHG-9123A型
电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司
DNP-9052培养箱 上海精密实验设备有限公司
AUTOCLAVE MLS-3020 JAPAN SANYO Elecric Co.Ltd
Nanodrop 2000超微量
紫外分光光度计 Nanodrop
Zwy-2102恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司
HHS-21-4恒温水浴锅 金坛市华欧实验仪器厂
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