牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎的检测(2)
牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是一种接触性的急性热性传染病，又称为红鼻病，病原为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)，临床特征是发热、呼吸困难、鼻炎和上呼吸道炎症等[7]。一旦IBRV侵入，则会顽固性的潜伏在牛体中，对机体造成持续性的感染，感染牛会长期甚至终生带毒，使得养殖场难以控制和治疗该病。IBR在世界各地都有发病情况，对养牛业危害极大，对我国经济也造成了难以估量的影响。我国规定，进出口牛及其肉制品必须检测IBRV[8]。根据IBR流行病学概况及其病原学特征，其在牛群中易造成长期的潜伏感染和持续感染，定期监测并及时淘汰阳性动物是控制该的有效手段之一。所以，目前根除IBR的最有效途径是采用敏感的检测方法（如实时荧光PCR技术）诊断该疾病，检出阳性感染牛并扑杀[9]。唐泰山等[10]研究建立的实时荧光定量PCR技术,其灵敏度达到0.02TCID50，检测IBRV耗时短，精确度高，并且能够将野毒株和gE基因缺失疫苗株区分开来,这也为IBR的诊断、检测和研究等提供了有效手段。
本研究对全国不同地区的养殖场进行BVDV和IBRV的检测，得出数据结果，为该病的防控提供一些依据。也希望能引起该养殖场的高度重视，防止本病继续蔓延，保障畜牧业健康发展。
1 材料与方法
1．1 检测样品
分别来自江苏、浙江、安徽、江西、河南等地规模化奶牛场送检的血液样本。
1．2 主要检测试剂
1．2．1 BVDV抗原检测所用试剂 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原捕捉ELISA试剂盒（美国IDEXX公司生产）购自于北京爱德士元亨生物科技有限公司。
1．2．2 IBRV抗原检测所用试剂 牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）核酸检测采用“OIE陆生动物诊断与疫苗手册”第2.4.12章（2010）中的荧光PCR方法进行，引物与荧光探针由上海宝生公司合成。
1．3 送检样本的处理
送检的血液样本用移液器取1 mL上清加入到1.5 mL离心管中，置于离心机中，设置转速为8000 rpm，离心3 min后取出，然后吸取上层血清可以做ELISA试验用，下层余留约200 μL用于核酸提取。
1．4 BVDV抗原检测
按照 IDEXX牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原捕捉ELISA检测试剂盒说明书的步骤和要求进行检测。
1．4．1 操作步骤 首先，试剂盒的所有组分恢复至18~26 ℃，试剂全部混合均匀。取包被BVDV（Erns）的特异性单克隆抗体的酶标板，做好标记。每孔加入检测抗体50 μL，在阳性对照孔中加入阳性对照50 μL，在阴性对照孔中加入阴性对照50 μL，取被检样品50 μL按照顺序分别加入到其他反应孔中；用振荡器振荡混匀，37 ℃条件下孵育2 h；，孵育后用移液枪将反应孔中的液体吸出，打入废液缸中，取洗涤液300 μL加入每个反应孔中洗涤，洗涤5次（也可用洗板机进行洗板）。取酶标抗体100 μL加入到每个反应孔中，室温条件下（18~25 ℃）孵育30 min；孵育完成后取洗涤液300 μL加入每个反应孔中洗涤，洗涤5次；取TMB底物溶液100 μL加入到每个反应孔中，置于黑暗处室温（18~25 ℃）孵育10 min；取终止液100 μL加入到每孔中终止反应。
1．4．2 读数及结果判定 将酶标仪在空气中调零，在450 nm下读取对照组和样本的OD值，并计算结果。在对照结果成立的前提下，样品的校正OD值（S-N）＞0.300，则判定为阳性，即为待测样品中含BVDV抗原；S-N≤0.300，判定为阴性，即为待测样品中不含BVDV抗原。
计算公式：S-N=样品A450-NC。
1．4．3 试验成立条件 当结果满足以下几点时，实验有效：阳性对照OD450值（PC）与阴性对照OD450值（NC）的差值（P-N）必须大于或等于0.150 OD，阴性对照OD450值（NC）必须小于或等于0.250 OD，这样实验结果才成立。
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