猪链球菌2型侵袭脑微血管内皮细胞相关毒力因子的筛选(2)
目前，转座子随机诱变技术是发掘已知基因新功能、发现新基因等研究的有效途径之一。转座子随机诱变技术是将转座子引入细菌染色体中，在细菌基因组中随机插入某些基因，使靶点处的基因失活，得到大量基因突变株，从而构建出突变体文库，从其中筛选表型发生变化的突变株，进一步研究与该表型相关的被失活基因的功能[8]。
本研究利用转座子随机诱变技术构建猪链球菌2型ZY05719菌株转座子突变体文库，通过人脑微血管内皮细胞（hBMEC）侵袭试验筛选出侵袭能力减弱的突变株，进行反向PCR并测序，对比分析后鉴定出各SS2突变株的沉默基因，为进一步研究SS2侵袭能力相关基因及其功能提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株、质粒和细胞
猪链球菌2型野生型菌株ZY05719，于2005年四川猪链球菌2型疫情中由本实验室分离鉴定并保存。大肠杆菌购自天根生化科技（北京）有限公司。质粒pMar4s由本实验室构建并保存。人脑微血管内皮细胞（hBMEC）购自南京科佰（Sciencell）生物技术有限公司。
1．1．2 引物、试剂和仪器
试验所用引物（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1 实验所用引物
Table.1 Oligonucleotide primers used in this study
引物 序列[5] (5'–3')a 功能
oITR cccctgcagTAACAGGTTGGCTGATAAGTCCCCGGTCT TnYLB-1 design（PstI）
oIPCR1 GCTTGTAAATTCTATCATAATTG IPCR amplification
oIPCR2 AGGGAATCATTTGAAGGTTGG IPCR amplification
注：引物中的酶切位点由下划线标出。Restriction sites in primers are underlined.
THB购自美国BD公司；卡那霉素（Kanamycin，Kan）、壮观霉素（Spectinomycin，Spc）、庆大霉素、青霉素购自Sigma公司；Taq I酶，T4 DNA连接酶，2× PrimeSTAR HS (Premix)，DL2000 maker、DL5000 maker、DL15000 maker，TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit试剂盒购自大连Takara生物工程有限公司；2 × Taq Master mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Tiangen细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Omega Plasmid DNA Mini Kit试剂盒，Omega Gel Extraction Kit试剂盒购自Omega公司；核酸染料GoldViewTM购自北京赛百盛基因技术有限公司；FBS购自Gibco公司；DMEM购自HyClone公司；其它试剂均为国产或进口分析纯。
仪器设备：
GRP-9270型 隔水式恒温培养箱，上海森信仪器有限公司；
THZ-25 大容量恒温振荡器，太仓市华美生化仪器厂；
Thermo SCIENTIFIC LEGEND MICRO 17 微型离心机，赛默飞世尔科技公司；
Thermo SCIENTIFIC Fisher 高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司；
BECKMAN COULTER Avanti J – 30I 离心机，贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；
Eppendorf 5415R 低温微型离心机，德国艾本德公司；
Eppendorf 5415 常温微型离心机，德国艾本德公司；
Eppendorf basic 紫外可见光分光光度计，德国艾本德公司；
BIO – RAD GenePulser XcellTM电穿孔系统，伯乐中国公司；
Thermo SCIENTIFIC SHKE6000-8CE 低温摇床，赛默飞世尔科技公司；
Eppendorf PCR仪，德国艾本德公司；
JS-Power 600电泳仪，上海培清科技有限公司；
BIO – RAD Gel DocTM XR+ Molecular Imager凝胶成像系统，伯乐中国公司；
Thermo NanoDrop 2000微量分光光度计，赛默飞世尔科技公司；
XMTD-204恒温水浴锅，NUOHAI公司；
Thermo BB150二氧化碳培养箱，赛默飞世尔科技公司；