两种国产眼镜蛇毒抗血清的制备与检测(2)
眼镜蛇是眼镜蛇属或眼镜蛇科中的一些蛇类的总称，眼镜蛇科约有30多个种，而眼镜蛇属目前约有20多个已确认物种[16] ，以蛙、鱼、鼠、鸟及鸟卵等为食，分布于世界上的多个国家。中国境内的眼镜蛇栖息范围极广，孟加拉眼镜蛇在国外分布于北印度、尼泊尔、孟加拉、缅甸、泰国、老挝、越南等地，而在国内分布于广西、云南、四川、广东等。舟山眼镜蛇又为中华眼镜蛇为我国特产，主要分布于浙江、福建、广西、贵州、安徽、云南、湖南等省份。眼镜蛇栖息于平原、丘陵与山区，多见于灌丛、竹林、溪涧、稻田、路边、城郊，甚至花园或住房，白昼与夜晚均活动。其性情凶猛而且排毒量大，具有血夜毒素和神经毒素，被眼镜蛇咬伤的动物或人类发病速度快，易造成死亡。眼镜蛇毒对人的致死量为10 mg，而其一次的排毒量为79.1 mg，且具有极强的自主攻击性，每年在南亚和东南亚，发生数千起相关的死亡案例，引发的蛇伤危害十分严重[8] [17]。
来自流行病学数据分析，每年蛇类咬伤达10万人次，其中一半患者被毒蛇咬伤，预计需要注射抗血清5万人次，年使用量至少为10-15万支[7]。而眼镜蛇咬伤是南方最常见的蛇伤之一，咬伤病例居蛇伤病发率的第二位。目前中国大陆仅上海赛伦生物技术有限公司具备生产四种（蝮蛇、五步蛇、银环蛇和眼镜蛇）主要毒蛇咬伤的单价抗血清，且临床上使用的抗蛇毒马血清存在许多不足：制备周期长，抗体纯化的要求高，流通不方便、价格昂贵，以及蛇毒血清使用过程中可能带来的副作用等，使其生产与需求之间的矛盾一直不可缓解，从而影响了抗蛇毒血清在临床上广泛应用[3]。因此，在不断完善和总结抗蛇毒血清制备技术的同时，新的蛇伤治疗药物的开发和研究有着极其重要的意义[4][15]。
鉴于以上现状，本研究以传统抗蛇毒血清制备技术及其在蛇伤治疗药物研发中的进展为理论基础和技术参考[14-15]，依托杭州师范大学动物适应与进化杭州市重中之重实验室和两栖爬行动物研究中心，以孟加拉眼镜蛇和舟山眼镜蛇为对象，选择大白兔作为载体制备眼镜蛇毒血清，结合商用抗眼镜蛇毒血清，交叉检测蛇毒与抗血清之间的效价，希望能研制一种新型眼镜蛇毒血清[1-2]。
1 材料与方法
1.1 实验动物
本次实验所用的孟加拉眼镜蛇和舟山眼镜蛇蛇毒均为实验室自有制品，实验所用的小白鼠（重30 g左右）6只和成体大白兔4只(重约2 kg)均来自学校动物实验中心，大白兔置于24 ℃恒温室内单笼饲养，恒温室相对湿度控制在60%，光照16 h，在大白兔饲养期间提供干净和充足的兔粮[11]。每天观察大白兔行为状态：毛色光滑鲜亮，精神活泼，进食状态良好，对外来刺激做出快速的反应等，观察大白兔是为了方便随时判断其在实验期间的生理状态。
1.2 蛇毒采集
采集来自广西的孟加拉眼镜蛇（Naja kaouthia）和浙江的舟山眼镜蛇（Naja atra）活蛇数条。在动物实验中心饲养于25 ℃恒温室, 相对湿度为60%左右，至适应环境后，以活蛇咬皿挤压法获取孟加拉眼镜蛇和舟山眼镜蛇的新鲜蛇毒液，将蛇毒液称量并记录，然后冻干成粉末状，-80 ℃冰箱冷冻储藏以待备用。
1.3 抗原制备及大白兔免疫
本次实验的动物免疫主要参照Gao等的方法[9-12]，并根据实验的具体需求进行适当的调整，从-80 ℃的超低温冰箱中取出已经冻干的孟加拉眼镜蛇和舟山眼镜蛇蛇毒，于室温下放置一段时间，使冻干的蛇毒到达室温，然后用天平称取所需要的实验用量，用适量的生理盐水溶解，蛇毒溶液终浓度控制在20 μg/μl。这两种蛇毒溶液置于60 ℃的恒温水裕锅中孵育30 min减毒制备类毒素[6]。离心之后取上清，放入-20 ℃冰箱内低温保存，以待备用。在正式进行大白兔蛇毒免疫实验之前，先用以6只小白鼠作为预实验对象，随机分成两组，用生理盐水配制0.5 μg/μl和0.7 μg/μl浓度的蛇毒减毒溶液分组注射，之后观察24 h内小白鼠的存活状况，通过对小白鼠的预实验我们最终确定正式实验大白兔的免疫剂量为0.8 mg/μl。大白兔在恒温室饲养2个月后，已经完全适应恒温室环境。将蛇毒放置于60 ℃水浴锅孵育1.5 h进行减毒处理，将减毒的蛇毒溶液与完全弗氏佐剂1:9混合，随后进行30 min乳化，使蛇毒溶液和完全弗氏佐剂充分混合。以0.8 mg/kg的剂量对大白兔进行初次免疫，对大白兔背部、四肢腋下皮下及肌肉多位点注射[5]。在初次免疫后的第14、28、42天改为不完全弗氏佐剂混合乳化后进行3次加强免疫，免疫的剂量与初次免疫一样。初次免疫前一天抽取大白兔耳缘静脉血样，每只取血1.5ml。之后的3次加强免疫前都抽取大白兔耳缘静脉血，用ELISA检测方法观察血清变化。最后完成免疫一周后抽取大白兔耳缘静脉血，用ELISA进行血清含量检测，若达标再一周后心脏取血。
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