乙酰胆碱酯酶的化学法固定研究(2)
1.2 酶固定化方法简介[5]
固定化酶（immobilized enzyme），酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。A ch E固定化技术很多，常用的传统固定化技术包括吸附法、包埋法和交联法。
1.2.1 吸附法
吸附法是利用范德华力、离子相互作用和氢键等作用力使酶吸附到特定载体或电极上。Andre esc u(等人利用吸附法将A ch E固定到一次性丝网印刷石墨电极上，该方法可使电极连续使用8次，在真空条件下储存50 d后活性仍保持不变。吸附法固定酶可以使酶活性中心不容易被破坏，但是吸附过程相互作用力弱，容易导致酶脱落。
1.2.2 包埋法
包埋法是将酶包埋在高聚合物网格内。Z e j li等人用氧化铝溶胶凝胶溶液包埋A ch E，由于溶胶-凝胶网孔很容易和电解质溶液中的农药接触，所以得到较高的抑制率，对毒死蜱的检测限达到 。包埋法很少改变酶的高级结构，所以酶活回收率较高，但是由于凝胶类物质网格空隙大小不一样，有可能会造成酶流失的情况。
1.2.3 交联法
交联法是利用双官能团或多功能团试剂在酶分子之间、酶分子与电极基底之间交联形成网状结构对酶进行固定化。多种交联试剂中最常用的是戊二醛。Vi s wan a than等人将纳米尺寸的聚苯胺涂抹到包裹着单链DNA单壁碳纳米管膜上，然后再固定在金电极上，用戊二醛交联法将乙酰胆碱酯酶固定到修饰电极上，该传感器对甲基对硫磷的检测限达到了 。用戊二醛交联法固定酶时通常会使用牛血清白蛋白，主要是因为牛血清蛋白可以让较多的分子间成键，防止酶分子过于拥挤，同时也为酶分子提供了合适的微环境，保护酶和防止酶的泄露，提高了检测灵敏度。但交联法也有自身的缺点，比如难以控制反应、所需的生物样品量较多、扩散阻力大和酶蛋白在多分子的固化层中活性会降低等。
1.2.4新型A ch E固定化技术
每种固定方法都会使酶的活性受到损失，保持固定化酶活力的根本方法是保持酶的空间构象不发生改变。除上述常见固定化方法外，现在许多新型方法也不断出现，比如根据酶的等电点控制pH使酶带上电荷，然后与带有相反电荷的载体膜以离子键形式相互作用进行层层组装，也可以利用纳米材料的优越特性对酶进行固定。这些新型的固定化方法可以控制固定化酶层中酶的含量和分布，使酶不容易脱落，而且在一定程度上可以保护酶的活性，对于研究酶生物传感技术具有重要的实际意义。
1.3化学法固定化酶介绍
化学法固定化酶大方向有两种方向，一种是载体结合法，另一种是交联法。
载体结合法：最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。
交联法：依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
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