基于G-四链体的非标DNA探针荧光检测核酸内切酶(2)
限制性核酸内切酶简称限制酶，是能够识别DNA的特异性序列，并在识别位点或者其周围切割双链DNA的一类内切酶，它们是从原核生物中分离提纯出来的。限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用，为遗传工程的产生拉开了序幕并获得1978年医学奖和诺贝尔生理学奖[6]。在现代药物发现和分子生物学试剂中，基于发展新的能够屏蔽蛋白质与DNA切割的技术，核酸内切酶已成为一个主要目标。核酸酶的识别和切割DNA的一个分支序列具有很高的特异性[7]。事实上，在现代的发展分子生物学中，核酸内切酶也被认为是重要的工具和在传统上用作模型系统。核酸内切酶在DNA蛋白质相互作用中也可用于其机理研究[8]。发展快速灵敏的方法检测核酸内切酶的活性及抑制剂对于现代分子生物学的发展有重要意义[9]。
G-四链体是由具有连续富G序列的DNA或RNA形成的一种特殊的核酸二级结构，它是由四个鸟嘌呤碱基G通过Hoogsteen氢键的配对方式首尾连接构成平面的G-四分体，相邻的G-四分体平面之间又通过π-π堆积作用而形成的[10]。对于一些富含G的寡核苷酸序列而言, 当其形成G-四链体结构时，可极大地增强氯化血红素(Hemin)的过氧化物酶活性, 因此可被开发成为一种有效的DNA酶[11]。G-四链体hemin DNA酶是一种由特定的核酸G-四链体与hemin结合后形成的具有过氧化物酶活性的人工模拟酶。当它们与 hemin 结合后，可显示出较强的过氧化物酶活性，催化H2O2参与的一些反应[12]。近年来，G-四链体-hemin DNA酶的研究越来越受到人们的关注，现已开发一系列高灵敏、高特异性的化学及生物传感器。目前，有关G-四联体-hemin过氧化物模拟酶在端粒酶活性分析、基因及基因突变诊断[13]、蛋白质定量测定、G-四联体稳定剂筛选、小分子及金属离子检测等方面的应用研究已陆续见诸报道[14]。N-甲基卟啉IX（NMM）具有不对称阴离子卟啉特征，对于G-四链体序列有显著的结构选择性，而对双链DNA、RNA和RNA-DNA杂交体或寡核苷酸的结合力较弱[15]。NMM在溶液中本身的荧光较弱，但是特异性嵌入G-四链体结构后，它的荧光显著增强，从而可以做信号输出发展一系列荧光传感器[16]。例如，胡等利用G-四链体嵌入NMM做信号输出构建了一种非标功能化的分子信标荧光增强型检测DNA和核酸酶[17]。赵等基于DNA连接反应和G-四链体结构发展了一种非标荧光DNA探针检测辅酶[18]。另外 DNA二级结构G四链体可能是药物设计的新的合适靶点[19]。
本文我们发展了一种基于G-四链体平台和非标记DNA发夹探针的荧光传感方法用于限制性核酸内切酶活性的检测[20]。DNA发夹探针在无目标EcoRI存在时，由于3'末端的硫代处理，能保护其不被核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)酶切而保持完整的发夹结构，NMM与双链DNA结合力较小，得到较弱的荧光信号。当目标EcoRI酶切识别位点引发ExoⅢ 酶切，生成自由的G-四链体序列，特异性嵌入NMM后荧光显著增强，从而实现对目标核酸内外切酶活性的检测。该方法利用核酸内切酶酶切的选择性和G-四链体序列与NMM结合的特异性实现对核酸内切酶活性的简便灵敏检测，从而为DNA与蛋白质相互作用研究提供了一个新方法。
1实验部分
1.1实验仪器
荧光光谱仪：JASCO FP-750 日本分光公司；离心机：型号TDL-4，紫外光谱仪 型号UV-530，上海安享科学仪器厂；pH计，恒温水槽。
1.2 实验药品和试剂
EcoRI核酸内切酶，核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）购自于纽英伦生物技术（北京）有限公司；
染料N-甲基卟啉二丙酸 IX（NMM），百灵威科技有限公司；
1×Buffer EcoRI (50mM Tris-HCl (pH7.5 at 37℃),10 mM MgCl2, 100mM NaCl, 0.02% Triton X-100, 0.1mg/ml BSA)；2×HEPES缓冲液(40 mM HEPES, pH=7.4, 10 mM MgCl2, 20 mM KCl)；正钒酸钠（Na3VO4）购于生工生物工程(上海)股份有限公司；
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