基于G-四链体的非标DNA探针荧光检测核酸内切酶(3)
DNA序列（HP）由自己设计从生工生物工程(上海)股份有限公司合成纯化得到。
序列组成为：（5'-3'）
GTGTGTGAATTCGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGTTAAAACCCAAAACCCAAAACCCGAATTCACACACTTTTT（3'末端红色碱基T硫代修饰）
1.3实验步骤
实验准备：用1×NEBuffer 2将发夹探针的大浓度溶解液稀释至5M, 然后经过极热极冷的淬火过程形成稳定的发夹结构，接着放置在冰箱上层保存备用。
取0.6 mL的离心管，加入12 L (5 M HP), 6 L 10×EcoRI 缓冲液和36 L灭菌水，待混合均匀后，加入6 L不同浓度的EcoRI核酸内切酶，混匀后37度下反应1.5 h。后加入5 L ExoⅢ (2 U/ L)和35 L灭菌水, 并在37度酶切30 min，接着向上述反应液中加入1.5 L NMM染料（100uM）和98.5 L 2×HEPES缓冲液，震荡混匀，室温放置30 min后，立刻在荧光仪上进行检测，并及时保存记录数据。荧光激发光谱设置为399 nm, 发射光谱收集从570-650 nm, 荧光数据均使用专业软件Sigmaplot进行处理。
2 结果与讨论
2.1实验原理与DNA探针设计
图 1 非标记发夹探针荧光检测核酸内切酶活性的原理示意图
本实验设计了一条非标记DNA发夹型探针荧光检测核酸内切酶EcoRI的活性，并对其抑制剂的抑制作用进行了定量表征，实验原理如图1所示：实验中的DNA探针HP 3'末端的几个碱基硫代修饰，序列中包含特异性结合NMM的G-四链体序列。在一定杂交条件下，HP可以自杂交形成DNA发夹结构，从而将G-四链体序列封闭在HP的茎端部分。该发夹探针的茎端含有核酸内切酶的识别位点，3'末端突出一小段单链DNA。无目标内切酶EcoRI时或向EcoRI中加入抑制剂焦磷酸盐后，发夹探针不能被酶切而保持完整的发夹结构。加入ExoⅢ，由于HP末端的硫代修饰保护不被ExoⅢ 酶切，HP仍然保持完整的发夹结构，不能释放自由的G-四链体序列。加入荧光染料NMM，由于NMM和双链的结合力较小，因此得到较弱的荧光信号。有目标内切酶时，EcoRI酶切发夹茎端的识别位点，将发夹HP从茎端切开成三段产物。然后加入ExoⅢ，发夹产物中的主体部分由于失去3'末端的硫代修饰保护，从而被ExoⅢ降解释放自由的G-四链体序列。在钾离子作用下，G-四链体序列形成稳定的G四股螺旋结构，再嵌入荧光染料NMM后，荧光显著增强。荧光信号强度与EcoRI浓度成正比，通过对荧光信号的监测可实现对目标内切酶活性的检测。利用该实验方案还可以对核酸内切酶活性的抑制剂，例如焦磷酸盐的抑制作用进行定量表征，从而有助于进一步研究DNA-蛋白质相互作用机理。
2.2 实验原理验证
图 2 不同实验条件下的荧光发射光谱图
为验证实验原理的可行性，我们收集了不同条件下的荧光光谱进行对比考察。如图2所示，曲线e是在缓冲液中NMM自身的荧光信号。当向上述溶液中加入发夹探针HP后，由于NMM和双链DNA的结合力较弱，因此只得到一个类似的弱荧光信号（曲线d）。当向曲线d的反应液中加入0.1 U/L的EcoRI和ExoⅢ后，内切酶的酶切诱导ExoⅢ降解发夹HP释放游离的G-四链体形成四股螺旋结构，嵌入NMM后，得到较强的荧光信号（曲线a）。如果上述溶液中不加EcoRI，得到一个空白荧光信号（曲线c）。当把EcoRI加热失去活性再加入到上述溶液中，因为失活的EcoRI不能酶切发夹茎端的识别位点，因此得到一个类似空白信号的弱荧光信号（曲线b）。综合以上分析结果，本实验方法的原理是可行和正确的。
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