大肠杆菌（E.coli）表达系统由于其遗传背景清晰，培养操作简单，转化效率高，生长繁殖快，成本低，目标蛋白快速大量生产等优点，被广泛用于外源蛋白的表达。该系统在许多研究工作中发挥了非常重要的作用。然而，在商业应用中，许多蛋白质产物由真核基因编码并具有高级的三级和四级结构，其需要翻译后加工成正确的折叠形式或糖基化蛋白质。由于大肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核细胞具有很大的不同。因此在应用大肠杆菌系统表达真核基因时，有必要利用代谢工程或进化的方法改造细胞[6]，解决大肠杆菌表达系统的局限性，提高产物的活性。随着研究的不断深入，大肠杆菌重组蛋白包涵体的复性和大肠杆菌的热源性等问题日益凸显。枯草杆菌由于其在活性蛋白的表达和分泌方面的优势越来越受到人们关注。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，非致病菌，其芽孢是其一种能抵御外界恶劣的环境条件的休眠体。与大肠杆菌不同，枯草芽孢杆菌被归类为“通常认为安全的”（GRAS）生物，并且不含内毒素，可以通过Sec和Tat途径将蛋白质直接分泌到培养基中[7]，并且易于进行遗传操作和实验处理。此外，该细菌达到特定密度的生长时间仅在数小时内，因此可以容易地应用于所需的大规模工业生产中。最近，已经通过使用各种类型的启动子开发了用于枯草芽孢杆菌中异源基因表达的表达载体，并且已经使用该宿主重组合成和纯化了各种靶蛋白[8,9]。枯草芽孢杆菌菌株也已被开发和工程化为核苷酸，维生素核黄素，调味剂核糖和补充剂聚γ-谷氨酸的工业生产者[10]。综上所述，枯草芽孢杆菌是极具应用潜能的异源蛋白质表达和分泌的理想宿主。目前，关于枯草芽孢杆菌表达鸡α干扰素的报道还较少。因此本研究通过构建穿梭质粒，电击法转化枯草芽孢杆菌，检测鸡α干扰素在枯草芽孢杆菌中表达情况，筛选阳性菌株并扩大培养进行目的蛋白纯化。本研究为枯草芽孢原核表达系统表达鸡α干扰素提供一定的理论基础，同时也为下一步的规模化生产应用提供技术保证。

1实验材料

1.1质粒和菌株

含有鸡α干扰素基因的PMD-19T载体，PHNOCM-02质粒，大肠杆菌JM109由江苏省农业科学院国家生物制品研制中心提供。

1.2酶及主要试剂

限制性内切酶PstⅠ，xholⅠ，T4-DNA连接酶，RNAse购自大连宝生物工程有限公司。

PremixTaqPCR试剂，购自擎科生物科技有限公司。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，质粒小量提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。鼠源抗His标签单克隆抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG购自生兴生物技术公司。其他琼脂粉、蛋白胨、氯化钠等常规试剂为国产分析纯。

1.3主要溶液和试剂的配制

1.3.1细菌培养基

LB液体培养基：蛋白胨5克，氯化钠5克，酵母提取物2.5克，溶于450毫升

ddH2O，补足至500毫升，高压灭菌后备用。

LB固体培养基：根据上述液体培养基制备方法制备，另每100毫升加入1.5克琼脂粉末，高压灭菌后备用。TM液体培养基：Hipolypeptone10克，牛肉提取物5克，酵母提取物2克，加入800毫升的ddH2O溶解后调pH为7.0，补充至870毫升。高压灭菌后，加入20毫升50%灭菌葡萄糖，10毫升金属离子溶液（0.1克一水合硫酸锰，0.1克七水合硫酸亚铁，0.01克七水合硫酸锌，溶于100毫升ddH2O，过滤除菌）。

TM固体培养基：Hipolypeptone5克，牛肉提取物2.5克，酵母提取物1克，加入400毫升的ddH2O溶解后调pH为7.0，加入10g琼脂粉，补充至435毫升。高压灭菌后，加入50mLMgCl2（4.1g/100mL)，10毫升50%灭菌葡萄糖，5毫升金属离子溶液（0.1克一水合硫酸锰，0.1克七水合硫酸亚铁，0.01克七水合硫酸锌，溶于100毫升ddH2O，过滤除菌）混匀。待温度降至50℃左右加入500uLNeomycin（新霉素）混匀后倒平板，平板凝固后四度保存备用。