食性结构驱动的两种国产眼镜蛇蛇毒蛋白组含量的变异(3)
1.2 蛇毒高效液相分离与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
正式试验前对蛇毒进行处理，将眼镜蛇的所有蛇毒进行等质量混合，保存于‒80 oC超低温冰箱备用。源`自,吹冰`文.论"文'网[www.chuibin.com随后，从混合蛇毒中称取2 mg蛇毒冻干粉溶解于0.1 %三氟乙酸中，经15000 r/min 4 oC离心10分钟后，吸取蛇毒溶液的上清液，然后用针式滤头进行过滤。用Kroims C18柱（250×4.6 mm，直径5 μrn）分离蛇毒，选择1 ml/min的流速，其中流动相为0.1 %三氟乙酸和乙腈。洗脱条件设置为10 %乙腈5分钟，10-25 %乙腈15分钟，25-45 %乙腈80分钟，45-60 %乙腈20分钟。蛇毒分离过程中的检测波均要求为215 nm[17,18]。两种蛇毒均进行5次分离，分离过程中（除首次分离外）手动收集各个检测峰，用Labconco冷冻离心干燥机干燥后，保存于‒80 oC超低温冰箱备用。
根据Laemmli (1970)方法，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离手动收集的各液相峰对应蛋白。电泳条件为分离胶浓度12 %，浓缩胶浓度5 %或分离胶浓度18 %，浓缩胶浓度3 %。电泳结束后，取出SDS-PAGE胶，用0.2 %考马斯亮兰R250染色30分钟，随后用脱色液脱色1小时，用ddH2O充分清洗干净，最后用UMax2100扫描仪拍摄结果[19-20]。