1  材料与方法

1。1 实验材料与试剂

材料：浙江省丽水市庆元县山区野生种三叶青，种植于杭州师范大学塑料大棚中

仪器：紫外分光光度计、荧光定量PCR仪

1。2 实验方法

1。2。1 三叶青内生真菌的分离及鉴定

PDA培养基的配制：称取200 g去皮洗净的马铃薯切成小块，加水煮20-30 min（至能被玻璃棒轻易碾碎），双层纱布过滤得到滤液。在滤液中加入14 g琼脂，加热，这一过程中需不断搅拌防止糊掉，后加入葡萄糖20 g。将培养液定容至1000 mL，121℃灭菌20 min，冷却至60℃左右，最后加入链霉素（str）50 mg/L。来*自-优=尔,论:文+网www.chuibin.com

样品消毒、分离培养：挖取三叶青多年生块状根，用自来水冲洗干净。将块根浸泡在稀释一倍的NaClO溶液中灭菌30 min，再用无菌水冲洗3次。然后将块根切割成3×5mm的小块，切面朝向培养皿底部，每皿放置4-5块，置于上述配制的PDA培养基上。该过程在超净台中完成，同时在超净台中放置2个敞开盖子的PDA平板以检测操作环境的洁净度。对照组是将上述同样处理过的块根未经切割直接滚印于对照组培养皿中。取最后一次漂洗块根的无菌水涂布于对照平板，用于检测材料表面灭菌效果。将实验组与对照组置于28℃恒温避光中培养5天。

纯化培养：待菌丝体从三叶青块根切面长出时，选取形态不同的菌落菌丝，用接种环挑取其边缘部分转移到新的PDA培养基，重复至获得纯培养物。

真菌的鉴定：采用插片培养的方法，对纯化的内生真菌进行菌落培养特征和镜检特征的观察，参照《真菌鉴定手册》[6]对纯化菌株进行分类鉴定。

1。2。2 内生真菌代谢产物的获得

使用打孔器分别在纯化的真菌菌落边缘打取3块直径为5 mm的菌饼，将菌饼接种于100 mL PDA培养基中，28℃，100 r/min条件下震荡培养5天后，经无菌滤纸过滤得到滤液，即为内生真菌的代谢产物。