微波加热对牛乳氧化作用的研究(4)
1.3.1 牛奶的加热氧化条件
引起牛奶氧化损伤的因素众多，既有化学因素，如化学毒物与药物代谢、pH值等；又有物理因素，如压力、辐射、光照等；还有生物因素，如细胞呼吸等。牛奶加热分为普通加热和微波加热两种。普通加热通过普通加热，设定不同的时间和温度即可达到加热要求；微波加热可通过微波炉，经设定的时间即可。
1.3.2 光谱方法对牛奶中蛋白质氧化的研究
蛋白质分子具有紫外吸收现象。蛋白质分子中色氨酸（Trp）、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等侧链及肽键本身都具有紫外吸收，蛋白质在260~300nm之间的紫外吸收是由Trp、Tyr、Phe等侧链基团产生的[4]。Trp和Tyr在280nm附近有一个吸收峰；Phe在257nm附近有一个吸收峰。不同的吸光生色基团，其摩尔吸收系数不同。大多数蛋白质在280nm附近有一个强吸收峰，这主要是由于Trp和Tyr残基对光吸收的结果。
由于蛋白质α-螺旋构象中上下肽键之间电子相互作用与无α-螺旋构象的肽键对紫外线的吸收不相同，肽键在225nm附近也有一个特征吸收峰，因此通过紫外吸收变化即可判断蛋白质二级结构的变化。可采用光谱仪测定蛋白质在200nm-400nm之间的紫外光谱。
在蛋白质分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)。个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)也能发射荧光。Trp、Tyr及Phe荧光强弱顺序依次为：Trp＞Tyr＞Phe。通常，蛋白质的荧光在280 nm或更长的波长被激发，因此Phe在绝大多数实验条件下不被激发。蛋白质的内源荧光主要来自Trp和Tyr残基[3]。
1.3.3 蛋白质氧化结构性质的研究--羰基含量的测定
羰基的形成( 醛基和酮基) 是蛋白质被氧化后的一个显著变化,蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标，且相对较容易测量[4]。羰基含量是评价蛋白质的氧化程度的重要指标之一。蛋白质的氧化主要是在氧气及金属离子(Fe3+)的存在下，发生自由基传递反应，一般参与氧化反应的有N-末端的α-氨基、脯氨酸、精氨酸和赖氨酸侧链以及半胱氨酸[5]。
羰基的生成是一个复杂的过程，Zamora等(1999)[6]研究表明，脂质氧化产生的氢过氧化物及其次生产物也可与蛋白质的氨基酸残基反应，使蛋白质的羰基含量增加。
测定蛋白质羰基含量常用的方法主要有: 2,4-二硝基苯肼( DNPH) 比色法、硼氢化钠法、荧光素肼法、荧光胺法、免疫杂交法和酶联免疫法等。2,4-二硝基苯肼( DNPH) 比色法是测定蛋白质羰基含量的最常用的方法。其原理[7]为:蛋白质氧化后形成的羰基可与2,4-二硝基苯肼反应生成红棕色的2,4-二硝基苯腙沉淀，此沉淀用盐酸胍溶解后，在分光光度计上370nm处有吸光度值，从而测出蛋白质中的羰基含量。其含量用每毫克蛋白质中含有多少nmol的羰基来表示，这是测定羰基的最经典方法。另外，在实验室的一般测定也可以利用蛋白质与2,4-二硝基苯肼发生作用，生成棕色物质后再采用紫外分光光度计法、HPLC或者质谱检测，也可用抗2,4-DNP抗体、Western 印迹、免疫组化及ELISA法等进行快速检测。
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