小米糠固态发酵产抗氧化活性物质之间相互作用研究(2)
纳豆芽孢杆菌属细菌科、芽孢杆菌属，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，属于枯草芽孢杆菌的一个亚种[3]。纳豆芽孢杆菌是一种不产生毒素且对人体无病原性的安全菌株,它能分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤文素酶和脲酶等多种酶类,实验中使用纳豆芽孢杆菌用于小米糠的固态发酵可以使发酵进行的更充分，有利于后续实验的进行。
要全面地评价抗氧化物的活性，就要同时做不同条件下的抗氧化活性研究。本实验通过T-AOC测定、DPPH自由基清除能力测定、还原能力测定等多方面对小米糠固态发酵产物进行测定，以求最大限度地、客观地反应其抗氧化活性。
随着对氧自由基和抗氧化剂理论和研究的日益深入，尤其是发现一些人工抗氧化剂，如BHT、BHA以及TBHQ对人体会产生较多的副作用[4]之后，人们对天然抗氧化剂的重视程度日益增加。近年来，研究人员发现某些复合氧化剂的抗氧化活性较之各组分的抗氧化活性之和更高，即各组分之间存在一定的协同作用[5]，如：胡圣尧等发现超临界萃取后的紫草籽粗黄酮与文生素C、柠檬酸有一定的协同作用[6]，潘文洁等发现从咖啡渣中提取的抗氧化物与文生素C共同使用可替代BHT[7]。为了深入开发小米糠中的抗氧化活性物质，本实验对小米糠固态发酵产物中的多糖、多肽和酚类物质进行了粗提，并对多糖、多肽和酚类物质之间在T-AOC方面、DPPH自由基清除能力方面、还原能力方是否存在的协同作用及拮抗作用做了研究，以便于更深入的了解小米糠固态发酵产抗氧化物质间的相互作用。
1 材料与方法
1.1 菌种、材料与试剂
纳豆芽孢杆菌NattoD-3，由南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保存；新鲜米糠，购于山西省，正己烷脱脂处理，-18 ℃保存；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）由Sigma公司提供；总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒购于南京建成生物技术公司；培养基均为分析纯由国药集团提供。
1.2 仪器与设备
AY120电子天平 日本Shimadzu 公司； SX-700高压灭菌锅 日本Tomy公司； SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；DRP-9162型电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司； 5804R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；UV-2450紫外可见分光光度计 日本Shimadzu公司；ALPHR 1-4 LD plus型真空冷冻干燥机 德国Christ公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基、菌种活化和粗提液的制备
营养琼脂（Nutrient agar ，NA）培养基：牛肉浸膏3.00 g/L、鱼粉蛋白胨10.00 g/L、NaCl 5.00 g/L，pH7.0。在 121 ℃下灭菌 20 min。
固态发酵培养基：脱脂小米糠5.00 g，NH2CONH2 0.10 g， K2HPO4▪3H2O 0.02 g，蒸馏水6.00 mL，自然pH。在 115 ℃下灭菌 30 min。
将安瓿管中的菌种接入装有100 mL NA培养基的锥形瓶中，用八层纱布封口，置于空气摇床中扩大培养，在37 ℃条件下180 r/min ，培养20 h，使菌种活化。将在NA培养基中活化好的菌悬液接入已经灭菌的固态发酵培养基中，混合均匀，放入37 ℃电热恒温培养箱，每隔12 h摇晃锥形瓶通气，培养24 h后，将小米糠转移至培养皿中，放入60 ℃电热鼓风干燥箱内烘干至恒重，冷却至室温，精确称取烘干后的小米糠1.000 g置于25 mL试管中，加入10 mL的蒸馏水，于30 ℃下，在超声波清洗仪中超声提取30 min，然后转移上清液至离心管中于离心力10000×g下离心10 min，取上清液，通过0.45 μm滤膜，即得到粗提液，待测，各试验重复三个。