鲫鱼贮藏过程中微生物菌相DGGE分析及其防腐保鲜(3)
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活鲫鱼（400g-500g/尾）若干，购于南京市苏果超市，产于太湖。
菌种Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4，为本实验室保藏。
营养肉汤固体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂18 g、水1 000 mL，pH 7.0；平板菌落计数（PCA）培养基 北京陆桥生物技术有限公司。
MgO、硼酸、盐酸（均为分析纯）、甲基红、亚甲基蓝 国药集团化学试剂有限公司
1.2 仪器与设备
高压蒸汽灭菌锅 北京发恩科贸有限公司；5084R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；PCR 扩增仪 美国艾尔特公司；Dcode DGGE电泳系统（配有凝胶成像系统） 美国伯乐公司；隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；拍击式均质机 法国Interscience公司; Orion* 3-Star型pH计 美国ORION公司。
1.3 方法
1.3.1 菌落总数的测定
将从超市购买来的新鲜鲫鱼迅速带回实验室，重击鲫鱼头部致死。在无菌条件下用灭菌过的剪刀分别取25 g鱼肉样品放于无菌的均质带中并加入225 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理盐水；取10 g鱼鳃置于无菌均质袋中加入90 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理盐水中。将待测样品放入均质机中均质2 min。
具体操作参照GB 4789.2—2010《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》。
1.3.2 挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen， TVB-N）和pH值的测定
TVB-N按照GB/T 5009.44—2003《肉与肉质品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法进行测定。
pH的测定：取10 g样品加入100 mL的煮沸冷却后的蒸馏水浸提30 min，过滤后滤液使用经校正剂校正后的Orion* 3-Star型pH计进行测定。
1.3.3 提取DNA的样品处理
在无菌超净工作台中分别剪取鱼肉25 g置于装有50 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理盐水的无菌均质袋中；鱼鳃10 g置于装有25 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理盐水的无菌均质袋中，均质2 min，使菌充分溶于生理盐水中。用200目绢布过滤后取滤液，加入25 mL生理盐水，滤液1 000 r/min离心10 min，去沉淀，去除固体杂质，滤液1 0000 r/min离心10 min，弃上清液，使DNA沉降，沉淀加入5 mL无菌双蒸水，10000 r/min离心10 min，去上清液，将沉淀悬浮于1 mL TE buffer 中置于－20 ℃条件下备用。
1.3.4 总DNA的提取
按照OMEGA公司细菌基因组 DNA 提取试剂盒的方法操作，提取1.3.3中提取的细菌DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。
1.3.5 PCR扩增
参考陈慧斌等[ ]的方法采用PCR扩增鲫鱼鱼肉和鲫鱼鱼鳃中细菌菌群的16SrDNA V3区。