超声超高压以及高压均质技术对肌原纤维蛋白热诱导凝胶特性及分子特性的影响(3)
Physica MCR301流变仪 奥地利安东帕公司；
MUL-9000系列纯水机 美国密理博公司。
1.3 实验方法
1.3.1 肌原纤文蛋白的制备
冷鲜鸡胸肉购于南京苏果超市，去除肉眼可见的脂肪和结缔组织，切碎后称质量。参照韩敏仪等[8]人的提取方法于0~4°C条件下提取肌原纤文蛋白。使用三种提取缓冲液（缓冲液Ⅰ：25mM NaCl、5mM EDTA Na2、5mM Tris-HCl、pH7.5；缓冲液Ⅱ：0.1M NaCl、5mM EDTA Na2、5mM Tris-HCl、pH7.5；缓冲液液Ⅲ：2.5mM NaCl、5mM Tris-HCl、pH7.5）进行提取，具体方法如下：
取切碎好的鸡胸肉称重，假设为100g，使用组织绞肉机绞碎：绞碎速度为7000rpm，绞碎总时长为60s，注意每10s 暂停一次，避免机器运行产生的热量对肌原纤文蛋白产生不利影响。绞碎后加入1L缓冲液Ⅰ，使用高速匀浆机匀浆3min，每30s 停一次，在10000g条件下离心10min，弃上清，收集沉淀；加入0.5L缓冲液Ⅱ与收集的沉淀混合，再加入Triton X-100使其含量为0.5%，匀浆机匀浆1min，在10000g条件下离心10min，收集沉淀；加入0.5L缓冲液Ⅱ与沉淀混合，匀浆30s，过三层纱布，在10000g条件下离心10min，收集沉淀；加入1L缓冲液Ⅲ，匀浆30s，在10000g条件下离心10min，收集沉淀，即得肌原纤文蛋白。
以牛血清蛋白作标准曲线，用双缩脲法测定蛋白质浓度，最后用磷酸缓冲溶液（0.6 M KCl、20 mM K2HPO4、20 mM KH2PO4、pH 6.5）稀释蛋白至浓度为20 mg/mL。将样品分装于100mL烧杯中，储存于4°C冰柜中，在一周内使用完。
1.3.2 超声处理
参照Li等[5]的方法。称量60g样品分装于100mL烧杯中，另在烧杯外层套着装有冰水混合物的500mL烧杯。选用VC 750超声波细胞破碎仪进行超声处理，其操作条件为：输出功率750W、超声波频率20kHz、振幅60%、超声强度28-32 W/cm2。超声脉冲总共作用6min，超声时，探头（d=13mm）深入液面1.5cm，超声脉冲过程中工作时间和间歇时间分别为2s和4s。同时超声每隔30s需手动搅拌一次，保证样品均匀，控制样品温度在4～10°C。超声后于4°C冰柜保存。
1.3.3 超高压处理
参照Xue[9]等的方法。取30g样品分装于聚乙烯包装袋中，使用塑料薄膜封口机进行塑封，避免气泡。将样品放入在0.3L容量的850 Mini Food Lab高压容器高压容器（Stansted Fluid Power Ltd.，UK）中进行超高压处理。选择超高压处理参数为200MPa，9min。同时使用丙二醇和蒸馏水（30:70）的混合物作为压力转移介质，并通过热熔夹套将介质温度控制在25°C。超高压处理结束后立刻放入冰水混合物中冷却，而后放置于4°C冰柜备用。
1.3.4 高压均质处理
参照Chen[10]等的方法，使用装备有增压器以及75μm开放的Y型金刚石喷嘴的高压均质机对样品进行处理。高压均质机管道入口温度为4°C，样品在15000psi的恒定压力下通过，为保持出口温度能下降到20°C以下，需在出口管道外添加快速冷却系统，通过两次后即得样品，放置于4°C冰柜中保存。
1.3.5 测定前处理
分别取未经处理、超声处理、超高压处理、高压均质处理的6g样品加入10mL离心管中，避免产生气泡。放置水浴锅中，以1°C/min的升温速率将样品从25°C加热到75°C，并在75°C保温15min，结束后取出置于4°C低温室内过夜。准备第二天进行测量蒸煮损失和离心损失；用滴管吸取经不同非热加工技术处理后的6g样品放入10ml烧杯中，进行上述相同的蒸煮过程，准备第二天测量凝胶强度、T2弛豫特性。剩余样品则继续保存于4°C冰柜中，待进行流变特性、蛋白溶解度、活性巯基含量、表面疏水性等参数的测定。