超声超高压以及高压均质技术对肌原纤维蛋白热诱导凝胶特性及分子特性的影响(4)
1.3.6 凝胶保水性测定
参照卞光亮[11]等人的方法，做适当修改。
蒸煮损失（Cooking Loss，CL）：取3管前一天制备的肌原纤文蛋白热诱导凝胶，擦去离心管表面的水分后称重，离心管倒置晾干，残留水分用干燥滤纸小心吸干后准确称量，取3次测量的平均值作为测定结果。蒸煮损失用蒸煮前后凝胶质量损失的百分率表示。
计算公式：
CL(%)=(蒸煮前的质量-蒸煮后的质量)/蒸煮前的质量×100
离心损失测定：参照Kocher和Foegeding等[12]离心法测量，将制成的凝胶离心（1000g,15min）后，离心管倒置晾干，残留水分用干燥滤纸吸干，记录离心前后离心管的重量，取3次测量的平均值作为测定结果。
计算公式：
WHC（%）=(离心前的质量-离心后的质量)/离心前的质量×100
1.3.7 凝胶强度测定
测定前，将蒸煮后的样品去水，在室温中放置平衡2h后用TA-XT plus质构仪进行测量，通过P／5S型金属膜测定其凝胶强度（g）。其测定参数为：测前速度：2.00mm/s；测试速度：1.00mm/s；测后速度：1.00mm/s；距离:5.000mm；触发力：3.0g，每个处理3次重复。
1.3.8 LF-NMR自旋-自旋弛豫时间（T2）测定
NMR弛豫测量方法参照韩敏仪[8]的方法，略作修改。
准备前一天已蒸煮好的未处理组、超声组、超高压组以及高压均质组的凝胶样品，干燥滤纸吸干蒸煮出的水分，切取2g左右的样品放入直径为15mm的核磁管中，注意保证凝胶的完整性，预热至32°C将样品放入分析仪器中，对样品进行LF-NMR测定。T2使用CPMG序列测量，测定参数为：测试室温度为32°C，核磁共振频率为22MHz，τ值（90º脉冲和180º脉冲之间的时间）为350μs，重复扫描32次，重复间隔时间为6.5s，得到12000个回波，每个测试进行4次重复。CPMG指数衰减曲线用仪器自带MultiExp Inv Analysis软件进行反演，得到T2值。反演结果为生成弛豫图、各个弛豫过程的弛豫峰值、其对应的时间常数及其面积分数。
1.3.9 流变特性测定
使用磷酸缓冲溶液（0.6 M KCl、20 mM K2HPO4、20 mM KH2PO4、pH 6.5）将蛋白稀释至20mg/mL，流变仪选用50mm平行板，频率为0.1Hz，应变为0.0025，保持测量板与载物台间距为0.5mm，吸取大概10mL的蛋白溶液样品均匀涂布于测试板上，去除样品中的气泡，为防止挥发，蛋白与空气接触处需用液体石蜡覆盖。测定过程中先于20°C预热3min，后以1°C的升温速率从20°C上升至80°C，测定指标为各样品的储能模量G′、相位正切角δ(tan δ=G″/G′)。每个处理测定3个重复。
1.3.10 蛋白溶解度测定
使用磷酸缓冲溶液（0.6 M KCl、20 mM K2HPO4、20 mM KH2PO4、pH 6.5）将蛋白溶液浓度稀释至10 mg/mL后，在4°C高速冷冻离心机中20000g离心30min。取上清测其蛋白浓度，每个处理进行4次重复测定，蛋白溶解度根据以下公式计算：
溶解度（%）=离心后上清液中蛋白质浓度/离心前蛋白质的浓度×100
1.3.11 活性巯基含量测定
参照 Liu等[13]的方法，稍作改进。
使用磷酸缓冲溶液（0.6 M KCl、20 mM K2HPO4、20 mM KH2PO4、pH 6.5）将蛋白溶液浓度稀释至2mg/mL，取5mL样液先于25°C下保存5min，后冰浴10min。样液中加入20μL 5, 5′-二硫基-2-硝基苯甲酸 (DTNB, 10 mM)，漩涡震荡后在4°C避光保存1h。在412nm波长处测定样液吸光度，以13600L/ (mol•cm)系数计算巯基含量，每个处理重复4次，活性巯基含量的计算公式如下：