肠道微生物Akkermansia muciniphila的功能基因研究(3)
pCP20是温度敏感型的质粒，同时含有氨苄和卡那两种抗性基因。在42℃诱导时可编码翻转重组酶(Flipase Recombination Enzyme, FLP)，FLP能够和pKD4上的FRT位点特异性结合从而将卡那抗性基因和FRT位点消除。与此同时，pCP20由于对温度敏感也逐渐消失[17,18]。
质粒pKD4、pKD46和pCP20都保存于E.coli DH5α中，在-80℃冰箱冻存。Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835是用于同源重组的菌株，购于德国微生物菌种保藏库。
1.2 试剂与仪器
细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司；柱式质粒DNA小量抽提试剂盒 OMEGA Bio-Tek公司；卡那霉素、氨苄青霉素 Sigma-Aldrich公司；LB营养琼脂、脑心浸出液肉汤（BHI） 青岛高科园海博生物技术有限公司；Agar Powder 北京索莱宝科技有限公司；L-半胱氨酸盐酸盐无水物 上海麦克林生化科技有限公司；黏蛋白 上海源叶生物科技有限公司；引物 金斯瑞生物科技有限公司合成
高压灭菌锅 上海莱睿科学仪器有限公司；凝胶成像仪、电泳仪、电穿孔仪、0.1cm电极杯 Bio-Rad公司；基因扩增仪 Eppendorf公司；多功能酶标仪 美国MD公司；Nanodrop 2000 Thermo Scientific公司；厌氧微生物培养工作站 英国Ruskinn公司；高低温恒温培养箱 上海悦丰仪器仪表有限公司；恒温振荡培养箱 伊孚森生物技术（中国）有限公司；台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；高速冷冻离心机 德国Beckman Coulter公司
1.3 A. muciniphila基本生长特性研究
1.3.1 生长曲线测定
从-80℃冰箱中取A. muciniphila菌种，按5%接种于BHI+0.2%mucin新鲜液体培养基中活化，酶标仪测定菌体OD600达到0.15左右时，再将菌液按5%的量分别接种于3瓶60mlBHI和3瓶60mlBHI+0.5%mucin新鲜液体培养基中，另外设置未接菌液的BHI和BHI+0.5%mucin培养基作为对照，每隔4h用酶标仪测OD600，总共72h，整理数据绘制生长曲线图。
1.3.2 电镜前处理
根据生长曲线图，在BHI和BHI+0.5%mucin液体培养基中再进行一批菌培养,分别在其对数期和稳定期进入如下操作：将培养到相应时期的菌液转移到10ml离心管中，12000rpm离心3min，小心弃去上清液收集菌体沉淀。用1ml 1×PBS悬浮菌体细胞，吹吸几次彻底混匀，12000rpm离心1min，弃置上清液，重复该步骤两次以彻底漂洗菌体细胞，随后用100μl 1×PBS缓冲液悬浮并转移到2ml 2.5%戊二醛固定液中，放置在4℃冰箱中过夜，送样。
1.4 细菌DNA提取
依据绘制的生长曲线图分析明确A. muciniphila的生长规律，重新培养一批菌，等到OD600达到0.14左右时，再按照天根提供的细菌基因组DNA提取试剂盒上的步骤进行如下操作：
①按照每管6ml的量取达到相应OD值的AKK菌液到10ml离心管中，共10管，12000rpm离心3min，小心倾倒上清液收集菌体细胞。然后用移液枪吸取200μl GA缓冲液重悬菌体沉淀，接着往上述重悬液中添加20μl Proteinase K溶液，颠倒混合后加入220μl GB缓冲液，涡旋振荡仪作用15s，70℃金属浴10min，直至溶液变澄清透明。最后加入220μl无水乙醇，涡旋振荡仪15s，会出现部分不溶絮状物。
②将上述的整个反应体系用移液枪转移到套有2ml无菌收集管的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液后再次将吸附柱插回。沿壁向吸附柱中添加500μl GD缓冲液，12000rpm离心30s，倒废液后将吸附柱放回收集管。
③用移液枪沿壁向CB3柱中添加600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液后再次将吸附柱插回，重复漂洗一次。然后将空柱12000rpm离心2min后开盖干晾以彻底除去柱子中的漂洗液，以免影响后续实验的进行。
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