肠道微生物Akkermansia muciniphila的功能基因研究(4)
④将晾干的柱子换套到1.5ml无菌离心管上，用移液枪向柱子基质的中心垂直悬空滴加100μl洗脱液TE，室温孵育3min，12000rpm离心2min，收集DNA洗脱液。
最后将洗脱液置于-20℃冰箱保存。
1.4.1 DNA质量检测与送样
取部分DNA样品进行Nanodrop测定和琼脂糖凝胶电泳检测，分析其浓度和纯度。将符合建库条件的DNA样品交至诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组测序工作。
1.5 Akkermansia muciniphila基因缺陷株的构建
1.5.1 AKKGM001956基因敲除的技术路线
Red同源重组技术主要应用于原核细胞内的基因修饰，应用Red系统将AKKGM001956靶基因定向替换敲除主要依赖的就是λ噬菌体中具有重组功能的exo、bet、gam三个基因，它们可以分别编码Exo、Beta和Gam蛋白。Exo是一种核酸外切酶，逐步降解外源dsDNA的5’末端，产生3’突出端。蛋白质的结构也可以为其工作原理提出很多解释，Exo的晶体学研究中提供了一种罕见的情况：Exo蛋白在溶液中是环状三聚体，中心通道一端容纳dsDNA，而另一端仅可连接ssDNA[19,20]。Beta蛋白通过催化核酸外切酶产生的互补ssDNA的退火复性、介导链交换反应而作用于同源重组过程[21]，在其中起到了关键性的作用。Beta蛋白的结构会随着底物变化而调节，在寡核苷酸或ssDNA存在下，Beta蛋白会自发形成环状活性结构，紧密结合在由Exo蛋白产生的ssDNA的3’末端，保护产物免遭降解。等到dsDNA结束退火后，Beta蛋白就会从dsDNA上自发解离
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