新型纤维素酶的筛选和表达 (2)
宏基因组学作为一种新技术，不需要传统的微生物分离培养技术，因此也越来越受到研究者的器重，该技术能避开纯培养技术，可以直接研究收集到的微生物的基因组。所谓宏基因组学(etagenomics)，也叫元基因组学，是把样品中的所有的微生物全部的DNA为筛选对象， 为其研究手段为目的基因的筛选和(或)序列的测序和分析[7-10]。该技术的第一步是从样品中提取所有微生物所有的DNA，而后把这些提取的DNA片段连接到适合的载体上，例如大肠杆菌等，然后进行转化，从而构建一个重组的DNA文库，再从这些文库菌中通过筛选得到目的基因。宏基因组学对研究复杂环境中的微生物群落组成及其代谢产物具有重要意义，极大得扩充了微生物基因来源，增大了微生物基因资源的利用的几率，这也使得新的活性产物的发现频率大大增加。宏基因组学将会极大的帮助研究者在利用和探索基因资源等方面不断取得新的突破。通过宏基因组与其他技术相结合的方法，可以加快从环境微生物中发现天然产物的速度，对生产生活有重要意义。
目前利用宏基因组方法筛选目的基因的方法主要有两种，一种是通过表型筛选;另一类则是通过序列的筛选。大多数的产物都是采用表型筛选所得，表型筛选也叫功能筛选，它不需要通过对库中的基因进行序列分析，筛选到的基因可能与已知的序列相似性较低，因此通过表型筛选是从宏基因组组获取的目的基因的主要方式。
通过宏基因组技术可以开发新酶，目前通过宏基因组开发的新酶的数量越来越多，说明该技术对新酶的发现有重要的价值，目前在食品方向比较受研究者关注的酶主要是脂酶和碳水化合物水解酶。本实验开发的新酶属于碳水化合物水解酶中的纤文素酶，纤文素酶可以应用于果汁开发，利用纤文素酶可以大大增加出汁率，提高产量。
本实验主要从云南土壤微生物基因组文库中分离获得纤文素酶高产菌株，采用七叶苷显色法，从基因组文库中筛选纤文素酶产生菌，七叶苷显色法的主要原理是：七叶苷在纤文素酶的催化作用下能将纤文素水解成葡萄糖和七叶苷原，七叶苷原能和 Fe3+发生呈色反应，颜色为棕黑色[11]，本实验主要采用柠檬酸铁铵作为Fe3+的来源。七叶苷显色技术可应于纤文素酶产生菌株的筛选。
通过七叶苷反应，从云南土壤微生物宏基因组文库中筛选出的具有纤文素酶活性的菌株，进行亚克隆操作后测序，通过序列分析，得到完整的纤文素酶基因序列。将得到的目的基因通过带有酶切位点的上下游引物，通过PCR扩增获得目的片段序列。然后将其与带有相同酶切位点的表达载体相连接，建立重组质粒。通过序列分析和七叶苷显色技术验证，再将阳性重组质粒分别转化到表达宿主中进行表达。实验中，表达系统用原核生物——大肠杆菌，该表达系统较常见，成本低，表达产物产量高，表达产物易分离纯化，为后续纤文素酶的酶的分离与纯化以及该种纤文素酶的酶学性质分析打下基础，有利于后续的大规模生产。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验样品
本实验室成功构建的云南土壤微生物宏基因组文库。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 筛选培养基
含纤文素酶基因克隆的筛选培养基采用LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10。
含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素，15μg/mL的氯霉素， 添加0.15%的七叶苷和0.25%的柠檬酸铁铵。
1.1.2.2 液体培养基
LB液体培养基，含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素，15μg/mL的氯霉素， 添加0.15%的七叶苷和0.25%的柠檬酸铁铵，主要用于菌种的稀释和培养。