四环素解构酶的异源表达与功能分析(2)
细菌为了能够在自然界激烈的竞争中存活下来，逐渐演化出对某些恶劣环境的适应能力，对抗生素的耐受是其中的一种。广泛地使用抗生素，使得对抗生素敏感的菌株不断被杀灭，剩余的少部分能够耐抗生素的菌株得以大量繁殖。随着时间的推移，这一过程被不断强化，最终导致耐药细菌的数量逐年增长，细菌的耐药能力也逐渐加强，四环素也不例外。张俊等[2]调查发现，在长期施用四环素残留猪粪的土壤中，四环素耐药菌的基因组DNA上抗性基因检出率为100%，质粒DNA上检出率为95.7%，而未施用四环素残留猪粪的土壤四环素耐药菌基因组DNA和质粒DNA均未检出抗性基因，证明了土壤中四环素残留量与抗性基因的增长存在显著的相关性。目前，环境中的四环素残留很严重，四环素抗性基因的增长速度可能会加快。因此，研究四环素的耐药机制，找到能够控制耐药性继续发展的方法显得尤为重要。
早在1964年，S. Okamoto和D. Mizuno等[3]就发现大肠杆菌耐四环素菌株具有耐药性是由于细胞对四环素的渗透率降低。20世纪80年代，Mendez和Marshall等人[4]先后发现了5种四环素外排泵蛋白（Efflux protein）Tet（A-E），将四环素耐药机制的研究带入了分子时代。随后，更多的四环素耐药基因被发现，除了具有外排泵作用外，还有保护核糖体和解构四环素等作用[5,6]。
目前为止，报道的编码四环素外排泵蛋白的基因已超过30个。外排泵蛋白存在于细菌细胞膜的磷脂双分子层中，以亲水氨基酸环的形式延伸到细胞质和周质空间中，逆浓度梯度将阳离子—四环素复合物泵出胞外[6]。另外，报道的编码核糖体保护蛋白的基因已超过10个，其中Tet(M)和Tet(O)这两个蛋白被研究最透彻。核糖体保护蛋白具有核糖体依赖的GTP水解酶活性[7,8]，它与核糖体结合并催化GTP水解，为核糖体构型变化供能，核糖体构型改变后，四环素不能与核糖体结合，因此不具备阻止蛋白合成的作用[8,9]，从而使细菌对四环素耐受。
与上述四环素外排泵和核糖体保护这两种耐药机制的研究相比，关于四环素解构这一耐药机制的相关报道甚少。根据报道，目前能够确定功能的四环素解构酶只有1个，即TetX。TetX蛋白由388个氨基酸组成，分子量为43.7 kDa。Yang等人[10]发现TetX是一种黄素单加氧酶，以FAD为辅酶。该酶在厌氧的条件下也能被合成，但是只有在O2和NADPH同时存在时才能表现解构四环素的特性，并且在pH 8.5时解构四环素的活性最高[10,11]。此外，Forsgerg等人[12] 从土壤样本中筛选出一组能够高水平表达四环素抗性的基因，这些基因能够编码解构四环素的蛋白，但是编码的蛋白与TetX的氨基酸同源性最多只有24.4%。对这几种蛋白做体外反应实验，HPLC结果显示有部分蛋白催化的反应与TetX催化的反应不同，表明可能有不同于四环素解构酶TetX的机制来分解四环素，但目前这种机制还没有被研究透彻。
本实验室利用宏基因组学功能筛选的方法，已经在珠穆朗玛峰土壤样本宏基因组文库中筛选出一个推测为携带四环素解构酶基因的阳性克隆（MQTet1435）。本课题延续前期工作，对筛选出的四环素功能基因进行蛋白表达，并解析其功能。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
克隆宿主E. coli EPI 100与表达宿主E. coli BL 21(DE3)均由本实验室保存。
克隆载体pET-30a(+)由本实验室保存。
四环素耐药阳性亚克隆MQTet1435 /E.coil DH5α由本实验室从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中筛选获得。