索拉胶生物合成相关基因的敲除及功能研究(2)
菌株ZX09能在含7.0% NaCl的无机盐培养基中生长，还能在PDA培养基和LB培养基上生长。该菌株菌落形态特别，细胞呈杆状，能分泌大量水溶性胞外多糖。可利用蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖、麦芽糖、纤文素和不可利用淀粉作为碳源。
ZX09发酵得到的胞外多糖性质稳定、产量高、提取工艺简便.该菌株在Htm培养基生长时，在胞外大量分泌一种水溶性多糖索拉胶（salecan）[2],这是一种含有少量α构象的1,3-β-D-葡聚糖，由于该多糖具有极其重要的生理学功能，所以近年来对该菌株的研究关注也逐渐上升。
1.2 索拉胶简介与生物合成
1.2.1 索拉胶的结构
索拉胶是由土壤杆菌ZX09以蔗糖为主要碳源发酵生产的一种高粘度胞外多糖[1,5]。结构分析表明，索拉胶由D-葡萄糖组成，不含支链和修饰基团的线型葡聚糖，由7个连续的β-1,3-糖苷键后接2个α-1,3-糖苷键连接组成其基本重复单元：→3)-β-D-Glcp-(1→3)-[β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→3)]3-α-D-Glcp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→，平均分子量约为2×106 Da。结构如图1.2.1所示。
1.2.1 索拉胶多糖的结构示意图
1.2.2 索拉胶的理化特性
索拉胶多糖无色、无、无臭、无毒，食用安全、易溶于水。工业化生产出的索拉胶是一种白色或浅黄色粉末，其组成成分约为糖分77.13%、蛋白6.2%、水分5.2%和灰分10.28%[2]。
索拉胶在水中能快速溶解，良好的水溶性和增稠性，只要很低的浓度就可产生很高的粘度。流变学试验表明，索拉胶溶液是典型的非牛顿假塑性流体，0.3%以上的溶液表现出良好的非牛顿假塑性特征，其粘度随剪切速率的增加而降低，且浓度越高剪切变稀越明显[2]。
1.2.3 索拉胶的生物活性
早期实验已经证实索拉胶具有一定的生理功能和生物活性。索拉胶发急性和亚慢性毒理分析表明索拉胶在测试剂量范围内（5%）食用无毒副作用[3]。体外试验表明索拉胶能抑制小鼠胰脏α-淀粉酶对淀粉的水解速度，有效延缓食物的消化，从而控制餐后血糖的过度上升[4]。高脂食物喂养小鼠肥胖模型试验结果显示索拉胶喂养可显著改善高脂食物引起的体脂、血脂和肝脂的增加及葡萄糖耐受性的降低等，抑制了脂肪的吸收和减少游离脂肪酸（FFA）诱导的细胞损伤；喂食索拉胶的小鼠，其粪便含水率明显增加，有利于粪便排出，表明索拉胶是一种潜在的治疗便秘的药物[6]。索拉胶多糖可减轻由酒精引起的急性肝损伤和由CCl4诱导的急性肝损伤，其保护机制是通过缓解胞内氧化压力和加速后期的肝细胞增生来实现的[6]。索拉胶作为一种新型的β-1,3-葡聚糖，其生物活性应与其分子中的β-1,3-糖苷键相关。但索拉胶因分子量较大导致粘度太大，使得在医药和临床上的应用受到了限制。因此制备具有低分子量和低粘度性质的索拉胶低聚糖，对实际应用意义重大。
1.3 基因敲除技术
基因敲除技术是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术[7,16]。基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除两种，完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。基因敲除的主要步骤包括构建重组基因载体；用电穿孔等方法把重组DNA转入受体细胞核内用选择培养基筛选已击中的细胞[8]。将击中细胞转入受体细胞并对其进行形态观察及分子生物学检测。
1.3.1 基因重组技术
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