索拉胶生物合成相关基因的敲除及功能研究(3)
同源重组是生物界普遍存在的现象，从噬菌体、细菌到真核生物都存在同源重组[9]。同源重组也是基因工程实验中常用的技术手段。基因的同源重组(homologous recombination),又叫基因打靶(gene targeting),是指外源 DNA 与受体细胞染色体 DNA 上的同源序列通过单一或双交换发生重组,并整合至受体细胞基因组中得以表达,从而改变了细胞某些遗传特性的方法[10,15]。Red重组系统为常见的同源重组系统。
1.3.2三亲本接合转移
三亲本杂交（tri-parental mating）接合转化法[11]，简称三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式，尤其适用于那些难以采用大肠杆菌Ca2+诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌[12]。非接合型质粒与接合型质粒有所不同，分子较小，缺少编码质粒转移体系所需的全部基因，因此不能像接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。如果在宿主细胞中存在另外一种溶合性的接合型质粒，也成为辅助质粒，非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒[12,13]的供体细胞中，再与受体细胞混合，促使两者发生接合转化作用，即将重组质粒导入受体细胞。
1.4 糖基转移酶简介
糖基转移酶（glycosyltransferases）最早是Hong等人[14]从酵母的突变株中克隆出(1,3)-β-葡聚糖的合成酶基因KNR4，并对它进行了分析。糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子[17,19]，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶（Glu-酶），葡萄糖苷转移酶是转移时连葡萄糖的糖苷键一起转移着的酶[18,20]。大多数糖基转移酶基因都具有靠近C端的富含甘氨酸(glycinerich)的保守区[21]，该保守区也存在于UDP糖基[18]和UDP葡糖醛酸基转移酶中。选择GenBank中注册的有代表性119条糖基转移酶序列，用PAUP 4.0软件进行系统分析，以近邻法构建系统进化树。进化树的分析结果表明，糖基转移酶基因之间亲缘关系的远近，并不能很准确的推断其生物学功能[22]。本课题中索拉胶的生物合成与糖基转移酶密不可分。
2 索拉胶合成基因敲除
2.1 实验材料
2.1.1 实验仪器
表2.1.1 实验所用仪器
设备 型号 厂家
移液器 Eppendorf 德国
PCR仪 S1000 美国Bio-RAD
电泳仪 EPS-300 上海天能
分析天平 FA2004 上海良平仪器
电子天平 JY302 上海浦春
旋转粘度计 NDJ-8S 上海平轩科学仪器
恒温金属浴 JS-400A 上海健生
高速离心机 Hitachi，RXⅡ 日本
恒温振荡器 HZ-9511K 江苏太仓华利达
生化培养箱 250B 江苏金坛宏华仪器
雪花制冰机 FMB100 上海比朗仪器
隔水式恒温培养箱 GSP-9050 MBE 上海博迅
立式压力蒸汽灭菌锅 YXQ-LS-30S11 上海博讯
智能数显恒温水浴锅 HH-4 巩义市予华仪器
2.1.2 培养基与试剂
本实验所用培养基及配方：
LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.0~7.2。
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