姜黄素类化合物对红细胞氧化损伤的保护作用(2)
红细胞对于氧化作用的响应十分灵敏，而且其代谢的机制简单，因此红细胞常被用作是建立抗氧化评价方法的一种理想模型[9]。由于红细胞中含有血红蛋白，在一定的氧化刺激下，随着血红蛋白被氧化，细胞膜破裂而发生溶血现象；故测定在一定波长下的吸光度值变化可监测溶血进行的程度，根据溶血发生快慢可表征抗氧化剂活性强弱。王建舜等[10]通过AAPH诱导小鼠红细胞产生氧化性溶血研究姜黄素对红细胞溶血的抑制作用。结果表明，姜黄素抑制红细胞氧化性溶血作用随着浓度的增加而增强，并在浓度为120 μmol/L时效果最佳，此后趋于平稳。冯建英[11]从捕获自由基、对DNA氧化损伤的保护作用、对红细胞溶血的保护作用等方面研究姜黄素类化合物的抗氧化活性。研究结果表明，姜黄素类化合物能够捕获多种自由基，在模拟生物体系中对DNA、红细胞均有很好的保护作用，具有优良的抗氧化效果。Poorichaya等[12]的研究发现，姜黄素类化合物具有较强的清除DDPH自由基的能力，能显著抑制AAPH诱导的亚油酸氧化和红细胞溶血反应；其中，姜黄素的抗氧化能力较于其他两种姜黄素更高，双去甲氧基姜黄素的抗氧化活性最低。胡宗泽等[13]研究表明，姜黄素可显著降低肉鸡血清中的丙二醛（MDA）含量、显著增高血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。提示姜黄素类化合物通过抑制脂质过氧化反应和提高抗氧化酶的活性来增强机体的抗氧化功能。Zhang[14]利用AAPH诱导鸡红细胞产生氧化应激，比较姜黄素在内的七种天然色素。其实验结果显示，姜黄素对于AAPH 诱导的红细胞溶解和细胞凋亡现象有一定的缓解作用，并且红细胞中MDA含量显著降低，其效果呈一定的时间依赖性。Deng等[15]利用人红细胞，发现姜黄素较于文生素C对于AAPH诱导的红细胞溶血反应有显著降低的效果，且较于文生素C效果更优。这提示，由于姜黄素类化合物具有脂溶性，可以在在红细胞膜的磷脂部分整合进入，从而发挥其抗氧化的作用。
然而，对于去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的研究尚少，且这2种姜黄素类化合物与姜黄素之间抗氧化作用效果的差异尚不清楚，相关研究有待深入。在进一步的研究中，需要深入探讨这3种姜黄素类化合物在不同条件下抗氧化活性的差异性，为姜黄素类化合物作为一种新型抗氧化剂提供理论基础。
本课题选取红细胞作为试验对象，通过水溶性自由基AAPH诱导红细胞建立氧化应激模型，研究姜黄素类化合物的体外抗氧化活性，比较其体外抗氧化性能差异。
1 材料与方法
1.1 试验对象
4%红细胞
1.2 试验材料
试验中使用的姜黄素（CUR）、去甲氧基姜黄素（BDC）和双去甲氧基姜黄素（BMDC）（纯度为98%），由广州市科虎生物技术研究开发中心联合提供，产品为橙黄色粉末物质。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 AAPH诱导鸡红细胞的氧化应激反应
4%鸡红细胞按照1:1的比例加入合适体积的PBS溶液（4 C预冷，pH=7.4，含有150 mM NaCl，1.9 mM Na2HPO4和8.1 mM NaH2PO4），制备成2 %的鸡红细胞悬浮液备用。
AAPH通过生成水溶性的脂质过氧化自由基，可诱导鸡红细胞的氧化应激损伤。取2%浓度的鸡红细胞悬浮液，分别加入不同浓度的姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素（终浓度为0.5-10 μM），于37 C条件下孵育30 min。然后加入AAPH溶液（75 mM），充分混匀后恒温孵育5 h。
1.3.2 AAPH诱导鸡红细胞溶血率的测定
红细胞溶血率的测定具体步骤如下：每隔1 h取出等体积的鸡红细胞悬浮液，于1500 ×g条件下离心10 min，弃上清。按1:7的体积比，向红细胞沉淀中加入150 mM的生理盐水，充分混匀后于1500 ×g条件下离心10 min。取上清液于540 nm处测定吸光度，所得结果记为A。以双蒸水代替生理盐水，诱导鸡红细胞完全溶血，离心后取上清液于540 nm处测定吸光度，所得结果记为B。每个浓度样品溶液平行测定三次，取平均值计算。鸡红细胞溶血率的计算公式为：A/B×100%。