基于蛋白质组学的云南白药治疗溃疡性结肠炎药效物质基础研究(3)
1．5 结肠炎评估
结肠炎疾病活动指数（disease activity index，DAI）评估包括体重下降率，粪便粘稠度，是否有血便这几个部分。通过每日的观察、记录对每组的情况进行打分。体重下降率：0分，无下降；1分，＜5%；2分，5%-10%；3分，10%-20%；4分，＞20%。粪便情况：0分，正常；2分，稀便；4分，血便。
8天后，麻醉处死小鼠，解剖取结肠，测量结肠长度进行比较。取下的结肠组织分为两部分，一部分浸于4%多聚甲醛中，后期通过石蜡包埋，苏木精伊红染色，切片观察进行组织病理学评分。评分内容包括炎细胞浸润（0-3分）和组织损伤（0-3分）。另一部分结肠组织置于冻存管中，-20 °C保存待用。
1．6 蛋白质组学
1．6．1 蛋白提取与消化
将冻存管中的结肠组织取出，同组样品混合，通过液氮研磨，RIPA裂解液（购于碧云天公司）提取，4 °C、30 000 g离心15分钟，提取结肠组织蛋白。经BCA（bicinchoninic acid）方法定量后，每个样品取200 μg进行消化。
蛋白的消化运用了改进后的FASP（Filter-aided Sample Preparation）蛋白消化法[9]。首先利用超滤管离心，将溶解蛋白的RIPA裂解液置换成8 M尿素，使蛋白变性，暴露酶切位点。然后加入还原剂，5 mM二硫苏糖醇（DTT），打开二硫键，以及烷化剂，10 mM碘化乙酰胺（IAM），25 °C黑暗中反应40 min，防止二硫键聚合。再根据超滤离心管会拦截分子量超过10 KDa的大分子的特性，将尿素置换成0.5 M TEAB（triethylammonium bicarbonate）。最后，以1比50的比例加入胰蛋白酶4 μg，37 °C孵育16 h，离心后，就得到了经胰蛋白酶消化后的肽段。
1．6．2 iTRAQ标记和高PH反相分级
iTRAQ技术的原理是将4种或8种C或N元素同位素编码的标签，特异性标记到多肽的氨基基团上，通过进行串联质谱打碎，结合电脑软件自动化分析，可以同时比较4个或8个不同样品中某种蛋白质的相对含量或绝对含量。iTRAQ试剂包括三部分：一端是报告部分（reporter group），另一端是肽反应部分（peptide reactive group），中间是平衡部分（balance group）。等量肽段与等量iTRAQ试剂进行标记，这样，不同同位素在标记同一多肽后，在一级质谱检测中显示出相同的分子量，进过二级质谱打碎后，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团分别掉落，在质谱图低质荷比(m/z)区域，可检测到报告离子，在其后端检测到待测多肽离子，不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度即产生该多肽的蛋白质的表达量，同时，多肽内的酰胺键断裂，形成一系列b离子和y离子，得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体[10]。通过蛋白质定性和定量，由此可以得到一定疾病状态下的差异蛋白数据库。
通过微量分光光度计测量肽段浓度，每组取等量肽段，共分为四组：对照组、治疗组、造模组，第四组为前三组的等量混样。肽段的标记选用了四标的iTRAQ试剂盒（购于美国AB Sciex公司），标记方式如下：对照组114，治疗组115，造模组116，混样组117。标记后的肽段溶液真空离心挥干。
高PH反相分级通过高效液相色谱仪（Thermo，美国）完成。配制缓冲液A：98%水，2%乙腈，PH=10；缓冲液B：2%水，98%乙腈，PH=10。将挥干的肽段复溶于缓冲液A中，以0.2 mL/min的流速过C18色谱柱。设置流动相梯度如下：3-18%缓冲液B 30min，18-32%缓冲液B 15 min，32-98%缓冲液B 6 min，98%缓冲液B 15 min。分级时每分钟收集一管，共收集60管，最后间隔合并成10管，真空离心挥干。
1．6．3 LC-MS/MS分析
分级并挥干后的肽段溶于缓冲液A（2%乙腈，0.2%甲酸）中，终浓度约为0.2 μg/μL。通过纳升级液相色谱仪（Thermo，美国）进行分离，色谱柱选用了长度为15 cm，内径为75 μm的C18柱。以300 nL/min的速度进样，流动相梯度设置为3-55%缓冲液B（84%乙腈，0.2%甲酸），洗脱112 min。洗脱下的肽段进入LTQ-Orbitraq XL组合式质谱（Thermo，美国），经ESI电喷雾电离源打碎，离子阱分离，检测仪检测，得到质谱原始数据。
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