本研究将中医小儿哮喘缓解期的三种证候（肺脾气虚证，脾肾阳虚证，肺肾阴虚证）作为研究对象，并采用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术研究脾肾阳虚证儿童哮喘的特征性蛋白，有助于规范儿童哮喘治疗的证候辨证和分型标准，为阐明证候的生物学本质奠定科学基础。

2材料与方法

2.1实验样本

所有入选的病例和对照均为中国南方汉族人群，选取2014～2016年浙江省中医院儿科就诊的哮喘缓解期患儿血清45例及儿童保健门诊健康儿童志愿者血清15例。小儿哮喘缓解期组患者符合西医儿童哮喘诊断标准，且符合哮喘缓解期标准。小儿哮喘组根据中医辨证标准分为三个证候组（经两名中医师独立辨证后对分组情况无异议）：小儿哮喘肺脾气虚证组15例，小儿哮喘脾肾阳虚证组15例，小儿哮喘肺肾阴虚证组15例。健康儿童对照组15例，均为无哮喘及过敏性疾病史，且无其他系统疾病的健康儿童 [15]。本研究经杭州师范大学附属医院伦理委员会批准，所选患者均签署知情同意书。

表 2 1样本的临床资料分析

年龄（岁） 性别（女:男） 例数（例）

肺脾气虚证组 7.33±2.29 6:9 15

脾肾阳虚证组 7.53±3.07 6:9 15

肺肾阴虚证组 5.80±2.24 6:9 15

健康对照组 6.33± 0.49 6:9 15

（组间年龄、性别在两两比较中无统计学差异）

样本抽取周围静脉全血3 mL，空腹。血清的采集：全血采集在10 mL采血管中，在4℃垂直放置1-2 h，使血液凝结后4000 g离心10 min。从上层血清中取30 µl分装在0.5 mL离心管中，冷冻于-80℃冰箱备用，分装血清使避免反复冻融。

2.2实验试剂

二甲基亚砜( DMSO) ，生产厂家：美国西格玛公司；

Bradford蛋白浓度测定试剂盒，生产厂家：上海碧云天生物技术有限公司；

SDS，生产厂家：BioRad公司； Tris，生产厂家BioRad公司；

iTRAQ标记试剂-8 plex，生产厂家：AB sciex公司；DTT，生产厂家：BioRad公司；

IAA，生产厂家：BioRad公司； Spin-X 0.22 μm超滤管，生产厂家：Corning公司；

Urea，生产厂家：BioRad公司；

VIVACON 500 10KDa超滤管，生产厂家：Sartorius公司；

Human 14 多重亲和去除系统色谱柱，生产厂家：Agilent公司。

2.3主要实验仪器

电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海有限公司）；可见紫外分光光度计购自Eppendorf公司；超级洁净工作台购自博讯实业有限公司医疗设备厂；高压灭菌器购自美国Zealway公司；AFZ-1001-U艾科浦超纯水系统购自上海百特科技有限公司；低温高速离心机购自Eppendorf公司；Milli-Q超纯水仪；LTO Velos质谱仪购自Thermo公司；酶联免疫检测仪购自Thermo公司；Q-Exactive 质谱仪购自Thermo公司；EASY column 色谱柱购自Thermo scientific公司；Thermomixer 恒温混匀仪购自Eppendorf公司；AKTA Purifier 100色谱购自GE Healthcare公司；超声波系统150-96购自Biosafer公司；真空离心浓缩仪购自Eppendorf公司；小胶电泳系统Mini-PROTEAN Tetr购自BioRad公司；超低温冰箱购自Haier公司。

2.4实验方法

2.4.1血清差异蛋白的鉴定及定量

去除血清高峰度蛋白：将每组15例样本等量混合成一个样本池以减少样本个体差异的影响，四组血清样本分别混合后使用Human 14 多重亲和去除系统色谱柱去除各组血清中14种高丰度蛋白质，包括白蛋白、抗胰蛋白酶、IgA、IgG、IgM、转铁蛋白、触珠蛋白、纤维蛋白原、α1-酸性糖蛋白、α2-巨球蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、转甲状腺素蛋白和补体C3。四组样本血清在去除血清高峰度蛋白之后，收集低丰度洗脱峰并合并，合并步骤为：使用15 mL 5KDa超滤管进行超滤浓缩，并用25mM 碳酸氢铵溶液进行buffer置换，保持最后的总体积为40 μL。向各组样本中加入40 μL SDT裂解液(4% SDS, pH8.0 100mM TrisHCl，100mM DTT)，充分混匀，100℃水浴加热5min，蛋白浓度定量后两组样品分别进样10 μg，用SDS-PAGE分离，观察高丰度蛋白去除效果。