去除高丰度蛋白后的脾肾阳虚证组的血清蛋白浓度为1.904 μg/μL，肺肾阴虚证组的血清蛋白浓度为2.158 μg/μL，肺脾气虚证组的血清蛋白浓度为2.319 μg/μL，健康对照组的血清蛋白浓度为2.075 μg/μL。

样品酶解：四组样品各取300 μg，每份加入200 μL UA buffer（8M Urea，150mM Tris-HCl pH8.5）混匀，再转移至30KDa超滤管中，高速离心机14000g室温离心30min，弃去滤出液，此步骤重复3次。再在所得样品中加入100 μL IAA（50mM IAA in UA），于恒温混匀仪上600 rpm振荡混匀1min，避光室温 300rpm孵育30min，14000 g 室温离心 30min。加入100 μL UA buffer，室温14000g离心30min，此步骤重复3次。加入100 μL 1/10 Dissolution buffer（500 mM TEAB），室温14000 g离心30 min，此步骤重复3次。最后弃去滤出液并加入40 μL Trypsin buffer（2 μg Trypsin in 40 μL 1/10 Dissolution buffer），放置于恒温混匀仪上（300 rpm，18 h，37 ℃）。室温14000 g离心30 min 收集滤出液，换新收集管，加入40 μL 25 mM 1/10 Dissolution buffer，室温14000 g离心30 min ，取滤液，对肽段进行定量（紫外分光光度计，OD值280）。

2.4.2 iTRAQ的标记及检测

各组分别取约100 μg样品。四组血清样本按照AB公司试剂盒说明书（iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit，AB SCIEX）进行iTRAQ标记，标记的报告标签中，健康对照组的报告标签为113，脾肾阳虚证组的报告标签为117，肺肾阴虚证组的报告标签为118，肺脾气虚证组的报告标签为119。将标记后的所有肽段分别混合，进行SCX预分级。采用蛋白纯化系统AKTA Purifier 100 (GE Healthcare)，Column：Polysulfoethyl 4.6×100mm column (5 µm, 200Å) (PolyLCInc, Maryland, USA)；缓冲液：Buffer A 为10 mM KH2PO4 ，pH 3.0， 25% 乙腈；Buffer B 为10 mM KH2PO4 pH 3.0，500 mM KCl，25%乙腈。表2-2为SCX分级方案表。

表 2 2 SCX分级方案表

Time（min） %A %B Flowrate (ul/min)

0.00 100 0 1000

30.00 100 0 1000

30.01 100 0 1000

35.00 95 5 1000

35.01 95 5 1000

65.00 65 35 1000

65.01 65 35 1000

75.00 30 70 1000

75.01 30 70 1000

80.00 0 100 1000

80.01 0 100 1000

95.00 0 100 1000

95.01 100 0 1000

110.00