研究发现，DHV可分为三个血清型型，即Ⅰ 型（DHV-Ⅰ）、Ⅱ 型（DHV-Ⅱ）、Ⅲ 型（DHV-Ⅲ）[1]，各自的致病性、临床表现、病理特征以及流行病学特点不尽相同。目前，我国境内流行的DHV主要是I型1系毒株（DHAV-1）。针对该病原现行有效且较为传统的检测手段为病原分离方法和免疫血清学方法[10]，但由于其操作步骤繁琐、耗材数量巨大、耗费时间较长且灵敏度不高，难以精确定量分析，故利用分子生物学方法建立一种高效、灵敏、特异性强且可以进行精准定量的DHAV-1检测方法尤为重要。

因此本研究拟建立一种特异、敏感、稳定的实时荧光定量RT-PCR方法，并应用于临床上DHAV-1的检测。

1材料

1.1主要仪器

表格 1主要仪器及其品牌、型号

仪器 品牌 型号

实时荧光定量RCR仪 罗氏 LightCycler 96

PCR仪 东胜龙 二代ETC811

电泳仪 Tanon EPS 300

全自动数码凝胶图像分析系统 Tanon 1600

台式高速冷冻离心机 Hettich Mikro220R

微量分光光度计 Thermo Scientific NanoDrop

隔水式培养箱 风校 GHP-9050

气浴恒温振荡器 常州国宇 THZ-82A

1.2主要试剂

表格 2主要试剂品牌及用途

试剂 品牌 用途

RNA isolater Total RNA Extracqion Reagent Vazyme 病毒总RNA提取

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific RNA反转录

Gel Extacqion Kit QIAGEN DNA片段回收

Mini Plasmid Kit TIANGEN 质粒提取

dNTP Mix ZOMANBIO PCR

PremixEx Taq酶 TaKaRa 实时荧光定量PCR

1%琼脂糖凝胶、Trizol法中所使用到的无机试剂等常规试剂均由本实验室自行配制。

1.3模板毒株

DHAV-1 A66弱毒疫苗，由成都天邦生物制品有限公司提供。

1.4载体与菌株

质粒选用的是TaKaRa品牌的pMDTM 18-T Vecqor Cloning Kit；表达载体为大肠杆菌DH5α感受态细胞，由本实验室自行制备及-80℃冷冻保存。

2方法

2.1引物与探针

2.1.1引物与探针设计

查阅相关文献可知，DHAV-1病毒基因中VP1基因序列相对保守[3]，可用于引物及探针设计。根据所查阅文献中的遗传进化信息，从NCBI数据库中下载了84条已被收录的DHAV-1的VP1基因核酸序列。通过使用计算机软件DNAMAN进行多序列比对，找出了DHAV-1 VP1基因上相对保守的区域（图2-1）。以DHAV-1 A66（DQ886445.3）为模板，运用计算机软件Primer Premier 5设计引物和探针，选取了三对引物进行初步筛选比较。以最小Cq值及最大荧光信号为筛选条件，最终确定了一对可以特异性扩增出140bp核酸片段的引物（DHAV-1F、DHAV-1R）和TaqMan探针（DHAV-1P），引物、探针序列及其结合位点详见表3。上游、下游引物和TaqMan探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。