试剂 体积（μL） 终浓度（/μL）

上游引物 1.25 2.5×10-8μmol

下游引物 1.25 2.5×10-8μmol

dNTP Mix 25 ——

dd H2O 20 ——

模板 2.5 ——

2.2.4扩增产物鉴定

1) 制胶

称取约0.45g琼脂糖粉末，倒入三角锥形瓶中，加入30mL TAE（1×）溶液。将三角锥形瓶放置于微波炉中用中火加热至溶液沸腾（约1-2min）。戴上耐热手套，小心地取出三角锥形瓶并轻轻晃动内部溶液，直到琼脂糖粉末完全溶解。待溶液冷却到不烫手时（约40℃），向其中加入5μL Gelred核酸染料，摇匀后缓慢倒入制胶模中（避免产生气泡），根据样品数及上样量选择相应梳子插在适当位置上，静置，待其完全凝固后拔下梳子备用。

2) 上样

用微量移液器将8μL的Marker 2000添加至标准孔中，并将50μL PCR扩增产物添加至样品孔内。

3) 电泳

样品添加完成之后，关上电泳槽盖，立即打开电源。110V电压下恒压电泳40min。

4) 观察

在紫外灯光下观察凝胶并拍照，结果如图2-2所示。

2.2.5目的片段回收

DNA片段回收用的是QIAGEN的Gel Extacqion Kit商品化试剂盒，具体回收步骤如下：

1) 取1500μL EP管，准确称量空管质量。根据紫外灯照射下所观察到的DNA条带位置切割下含有条带的琼脂糖凝胶，切碎后放入EP管中，精密称量总质量并计算出所切割下来的琼脂糖凝胶的质量。

2) 将体积为琼脂糖凝胶质量3倍的Buffer QX Ⅰ溶液加入到EP管中。

3) 重悬QIAEX Ⅱ溶液，取30μL加入到EP管中。

4) 将装有混合液的EP管放入到预先升温至50℃的水浴锅中孵育，每隔2min重悬一次以保证QIAEX Ⅱ溶液分散均匀，10min后取出EP管，此时体系为黄色。

5) 室温条件，转速12000rpm离心30s。

6) 弃去上清，沉淀中加入500μL的Buffer QX Ⅰ溶液，轻轻重悬，并在室温条件下以12000rpm的转速离心30s。

7) 将沉淀物用500μL已预先加入了无水乙醇的Buffer PE缓冲液洗涤2次，轻轻重悬后在室温条件下以12000rpm的转速离心30s。

8) 弃去全部上清液（尽可能吸出），打开盖子空气干燥15min，直至沉淀全部变白。

9) 加入20μL ddH2O轻轻重悬沉淀，在静置5min使沉淀完全溶解，在室温条件下以12000rpm的转速离心30s，吸出所有上清液，将其转移到另一干净的1500μL EP管中，放于-20℃保存以备后用。

2.2.6浓度测定

使用微量分光光度计测定DNA片段回收液中DNA的浓度。

2.2.7载体连接

按表格6中各试剂用量在500μL EP管内配制5μL体系，轻轻吹打使体系内溶液充分混匀，随后向体系内加入等体积的Solution Ⅰ溶液。将整个反应体系置于16℃水浴锅内作用30min，然后放-20℃冰箱以备后用。