猪肺炎支原体醛缩酶的致病机制研究(2)
2.1.8 重组质粒DNA的提取、鉴定及测序 7
2.1.9 Mhp/FBA基因的SOE-PCR突变连接 7
2.1.10 原核表达载体pET-28a(+)/FBA的构建 8
2.1.11 连接产物的转化、重组质粒DNA的提取及鉴定 8
2.1.12 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE检测 9
2.1.13 蛋白的纯化 9
2.1.14 表达蛋白的Western-blot检测 9
2.1.15 蛋白浓度的测定 9
2.1.16 蛋白的冻干 9
2.1.17 蛋白浓度的测定 10
2.2 实验结果 .10
2.2.1 猪肺炎支原体FBA基因的扩增 10
2.2.2 Mhp/FBA基因的克隆测序 11
2.2.3 Mhp/FBA基因的SOE-PCR突变 11
2.2.4 pET -28a（+）/FBA重组质粒的构建与鉴定 12
2.2.5 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE检测 12
2.2.6纯化重组蛋白及Western-blot鉴定 12
2.2.7 BCA法测定蛋白浓度 13
3 Mhp168 FBA对猪气管上皮细胞的影响的探究 . 13
3.1实验方法 .13
3.1.1 猪气管上皮细胞的解冻 14
3.1.2 猪气管上皮细胞的铺板 14
3.1.3 猪气管上皮细胞的FBA接种 14
3.1.4 流式细胞术 14
3.1.5 Mhp168 FBA对猪气管上皮细胞糖代谢的影响 14
3.2实验结果 .14
3.2.1 流式细胞术 14
3.2.2 Mhp168 FBA对猪气管上皮细胞糖代谢的影响 15
4 测定Mhp168 F113和F333在KM2培养基中的代谢差异 .19
4.1实验方法 .19
4.1.1采集样品 19
4.1.2超氧阴离子浓度测定 19
4.1.3 丙酮酸浓度测定 19
4.1.4 过氧化氢浓度测定 19
4.2 实验结果 .20
4.2.1超氧阴离子浓度测定 20
4.2.2丙酮酸浓度测定 20
4.2.3过氧化氢浓度测定 21
5 讨论 . 21
致谢23
参考文献.24
附录.26
猪肺炎支原体醛缩酶的致病机制研究
引言
猪支原体肺炎(Mycoplasma al pneumonia of Swine, MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)感染造成的非致死性呼吸系统疾病，在世界范围内普遍存在，给世界各国养猪业造成巨大经济损失。Mhp在很多方面都与细菌相类似，但Mhp没有细胞壁，这是它与细菌主要差异 [2]。感染Mhp后，病猪会表现为无痰性的慢性干咳和饲料转化率低，除此以外，仔猪还会表现出生长迟滞[3]。在抗体阴性的情况下，MPS不表现年龄特异性。Mhp的主要传播方式为与病猪直接接触和空气传播。经报道[4]，Mhp经气溶胶的传播距离可达到5km，这是MPS难以净化和防控的最大原因。更为严重的是，MPS会降低病猪的免疫力并且为其他感染呼吸系统疾病创造条件。Mhp还会与胸膜肺炎放线杆菌等细菌病毒发生混合感染，致使病情进一步加重[5]。
长期以来，传染病学家始终难以确定MPS的病原体，有人认为是一种细菌，也有人认为是一种病毒。直至1965年由Mare和Goodwin[6]等首次在体外完成病原体的分离，才证实了其病原体是一种支原体。中国首株致病性Mhp毒株由上海市农科院从病猪肺部分离获得[7]。已有研究者[8]于2002年构建了Mhp的cDNA文库。并且通过原核表达系统完成了Mhp膜蛋白P46抗原的体外表达[9] 。冯志新、熊祺琰等[11]在猪肺炎支原体疫苗和检测方法上取得了进一步的成果。更深入了解猪肺炎支原体能够促进MPS诊断方法和净化方案的研发，从而能够更好地保障养猪业的发展。
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