猪肺炎支原体醛缩酶的致病机制研究(4)
图1 基因获得示意图
Fig 1 schematic diagram for Genes
表1 各阶段产物及特性
Table 1 Products and features at different stages
反应引物对 5`位置 3`位置 产物长度(bp) 产物退火温度(℃)
2F-3R 148 619 471 48.0
3F-1R 603 925 322 46.8
2F-1R 148- 末尾 779 48.6
1F-1R 44- -末尾 885 50.8
2.1.2 引物的设计与合成
使用软件设计出所需要的突变引物。首先对Mhp-FBA的编码区进行扩增。设计引物中应当含有两个酶切位点EcoR I和Hind III，酶切位点的选择与所使用的表达载体对应。设计出的引物序列如下：
Mhp-FBA-1-F：5`- CCCAAAGGAGAATTCCAACCCTAG -3`，
Mhp-FBA-1-R：5`- ATTGCAAGCTTATGCTTTGAATTTGCAGAAC -3`，
下划线处为酶切位点，引物合成全部由金斯瑞生物完成。
2.1.3 模板的制备
取出在-70℃保存的Mhp168株F113，按照DNA粗提取试剂盒说明书上的方法粗提Mhp全基因组DNA，详细步骤如下所示：
（1）取恢复到常温的支原体1mL，高速离心10 min，完全弃去上清；
（2）将支原体沉淀与40 µL ddH2O用移液器充分混匀；
（3）将EP管在水浴锅中沸水浴10 min，之后立刻置于-20℃冰浴10 min（冰箱内进行）；
（4）使支原体恢复到常温;
（5）高速常温离心10 min，上清即是粗提好的Mhp DNA模板。本文中所有高速离心即12000r/min。
2.1.4 扩增Mhp/FBA基因
以2.1.3中提取出的DNA为模板，添加已经设计好的引物进行PCR扩增目的基因。
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