猪肺炎支原体醛缩酶的致病机制研究(3)
在Mhp诱导细胞损伤的分子机理方面，Hwang等[12]发现Mhp可以通过NF-κB和MAPK通路引起小鼠巨噬细胞促炎因子的分泌。Damte D等[13]发现Mhp通过Ras/ERK、SAPK/JNK以及P38这三条MAPK途径诱导鼠肺泡巨噬细胞系产生NO、TNF-α、IL-1β 以及 IL-6，用抑制剂抑制这三条通路的激活可以显著降低Mhp诱导 NF-κB的活化，说明MAPK诱导NF-κB的活化可能参与了Mhp致细胞损伤的过程。在支原体诱导宿主细胞凋亡的分子机制方面，Into等[14]发现脂质关联膜蛋白可以通过诱导ROS（如O2- ，OH- ，H2O2等）产生介导细胞凋亡，Bai F等[15]的最新研究也表明Mhp的LAMPs能够通过诱导一氧化氮产生，ROS及caspsae-3的上调而介导宿主细胞的凋亡。以上研究结果表明了Mhp可能是通过诱导细胞凋亡和氧化应激导致宿主细胞的损伤，然而引起这些损伤的分子机制及Mhp与宿主细胞相互作用的分子机制还有待进一步研究。
因猪肺炎支原体不具有三羧酸循环的关键酶，其主要能量来自于糖酵解途径，所以糖酵解途径对支原体的生长繁殖至关重要[16]。糖酵解总方程式为1葡萄糖+2ADP+2Pi+2NAD+ ——>2丙酮酸+ 2ATP+ 2NADH+ 2H++2H2O，可被高浓度的ATP所抑制。NADH在后期代谢过程中会产生大量自由基，如O2- ，H2O2等[17]，如不及时清除，会对细胞造成损伤。研究表明[18]支原体糖酵解途径中的一些关键酶如醛缩酶（FBA）等定位于膜表面，这样能及时地捕捉胞外的葡萄糖，进而通过糖酵解途径获得能量供支原体的生长繁殖，Athanma A等[19]认为这可能是影响支原体致病力的重要原因。又因支原体没有能够水解糖酵解代谢产物的酶类[20]，无法及时清除糖酵解及糖酵解后续产生的H+，O2- ，H2O2等自由基及其他代谢物，会引致相应细胞的氧化损伤并且导致氧化应激。Choi SY[21]和Deblanc C [22]等分别用离体实验和在体实验上证实了肺炎支原体能够诱导感染仔猪氧化应激的产生。所以Mhp诱导的宿主细胞损伤可能与Mhp本身的能量代谢有关，FBA可能在其中起关键作用，但具体的分子机制还不清楚。
1 材料与仪器
1.1 质粒与菌株
猪肺炎支原体Mhp168 F113和F333由江苏省农科院兽医研究所猪病防控研究室保存；表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌BL21(DE3) 、Trans5α、Trans1-T1等感受态细胞(原核表达工程菌)购自北京全式生物；质粒载体购自TAKARA（大连）公司。
1.2 主要试剂与材料
DNA提取、PCR产物回收试剂盒等基因相关试剂盒均购于Qiagen；SDS、过硫酸胺、丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250以及四甲基乙二胺（TEMED）购自Thermo；细胞培养使用的RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自赛默飞世尔科技；过氧化氢试剂盒、丙酮酸试剂盒、超氧复合物试剂盒均购自江苏科铭生物公司。
1.3 主要实验仪器
Thermo scientific SL 16R高速冷冻离心机；SC-200 PCR扩增仪；JS-380A自动凝胶图像系统购自Bio-Rad；EPS-120电泳仪，电泳槽均购自TIGEN公司；细胞超声破碎仪购自欧诺仪器；美国博腾仪器有限公司 ELX800 全波长酶标仪（购自美国博腾仪器有限公司）；TRS-K100 全温振荡培养箱（购自华美生化仪器厂），开放式摇床（江苏荣华仪器有限公司），Ad Vantage PLUS ES3蛋白冷冻干燥机（购自美国Virtis）。
2 猪肺炎支原体FBA基因的克隆表达及鉴定
2.1实验方法
2.1.1 基因获得示意图
根据GenBank网站上已经登录的猪肺炎支原体的果糖1,6二磷酸醛缩酶全基因序列（CP _ 002274.1）了解到：果糖1,6二磷酸醛缩酶基因的长度为864bp。因为该基因片段含有两个稀有密码子，所以必须进行密码子的基因突变。首先通过生物公司合成前88 bp基因，后段根据引物重叠延伸设计方法自行设计相对应的突变引物，然后通过SOE-PCR法，即可得到猪肺炎支原体醛缩酶基因片段。详细情况见图1、表1.
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