狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体的制备(2)
世界上超过95 %的狂犬病死亡病例发生在亚洲和非洲，其中我国疫情较为严重，我国每年狂犬病发病死亡率排全球第二，仅次于印度[5]，应当加以重视。如今随着宠物犬，猫的日益增多，已与人的生活密切相关，增加了人患狂犬病的危险，需要我们更加重视狂犬病的防控。同时为了更好的防控狂犬病，需要加大对RABV致病机制的深入研究。尽管相关预防控制措施已经有效地减少和控制了狂犬病每年的发病率，但是流行病学调查显示，中国毒株分支极为复杂，尤其是在农村地区，人狂犬病的防控仍面临着巨大挑战[6]。目前已有许多国家由于地理环境优势以及各种综合措施的应用，彻底消灭了狂犬病，而我国却一直处于一个严峻的状况，虽然人主要通过犬只咬伤感染狂犬病，但家养动物，特别是农村地区的流浪犬和野生动物的接触又使得狂犬病的流行情况更加复杂，因此若想有效地控制狂犬病的流行，研究清楚狂犬病病毒的致病机制以及建立有效的检测方法是我国控制狂犬病的更好途径[6]，对狂犬病的防控有重要的指导意义。
本课题中研究的狂犬病病毒M蛋白（基质蛋白），全长609bp，由202个氨基酸残基组成，定位于病毒的囊膜上[7]，是一种连接蛋白，主要连接病毒核衣壳和外壳，为狂犬病病毒中最小的结构蛋白[8]，其氨基末端70个氨基酸作为其潜在的抗原决定簇，该片段的变异将影响宿主细胞对病毒的免疫应答。M蛋白作为狂犬病病毒中重要的结构蛋白，在狂犬病病毒致病性方面发挥着重要作用。Stefan Finke等人的研究中发现将M蛋白取代后的重组狂犬病病毒RNA不仅可以增加转录速率，而且减少了复制产物，揭示了M蛋白是一个抑制转录并刺激复制的调节因子[9]，由M蛋白包围的RNP复合物和刺突蛋白的协同作用被证明是病毒有效发芽所必需的[10]。而为了阐明狂犬病病毒M蛋白在病毒粒子形态形成中的重要性，应用缺失了整个M基因的RABV突变体感染细胞，得到的细胞上清液中完全不存在子弹形颗粒[8]。不仅如此，它在67-79个氨基酸的α-螺旋结构即N末端内有一个靶向线粒体的诱导细胞凋亡的靶向序列，证明了M蛋白可能与感染后期的病毒诱导细胞凋亡相关[11]。位于核周的M蛋白是否与抑制宿主RNA的核胞质转运有关，以及与凋亡诱导相关联需要进一步研究。除此之外，它可能通过多种机制触发细胞凋亡，不仅通过线粒体凋亡途径也值得探讨。到目前为止，狂犬病病毒的发病机制以及与宿主细胞的相互作用仍不清楚。而基础的分子生物学以及反向遗传学的实验技术，可以让我们对狂犬病病毒的组成结构，致病机制，免疫应答越来越了解。目前，单克隆抗体已在免疫学，血清学，检测疾病中得到了广泛的应用，具有特异性高，纯度高，以及可以大量生产的优点，是目前世界上最广泛应用的抗体。对于狂犬病病毒单抗的制备，Schumacher等人就在早期制备了多株单抗分别针对狂犬病病毒的不同蛋白，在将这些单克隆抗体按不同比例混合后，对小鼠进行免疫性实验时，结果表明该抗体可以对小鼠有保护性免疫，不会受到狂犬病病毒的侵害，即暴露前免疫[12]。而目前针对狂犬病病毒的单抗也已经被广泛应用于检测狂犬病，本研究为狂犬病病毒M蛋白制备单克隆抗体，此项目的开展为进一步检测狂犬病病毒，抗原表位分析，分型以及探讨M蛋白在狂犬病病毒感染机制中的致病性研究提供基础。
1.狂犬病病毒cvs11毒株M蛋白克隆与纯化
1．1实验材料
1.1.1 试剂，载体，菌种
PCR扩增用高保真酶购于Vazyme公司、凝胶回收试剂盒购于康宁生命科学有限公司、BL21大肠杆菌感受态由本实验室提供、克隆载体pET28a，Trizol购于Invitrogen公司、蛋白高分子量预染 Marker 均购于Fermentas公司、T4 DNA连接酶均购于Vazyme公司、质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司、琼脂粉，酵母粉，胰蛋白胨均购于北京钧尧生物科技有限公司、氯化钠购于西陇科学股份有限公司、Tris购于AMRESCO（美国）公司、EDTA，Tween-20，Tritonx-100，TMEMD等均购于北京索莱宝科技有限公司、考马斯染色液，脱色液由本实验室自己配置，镍柱购于QIAGEN公司，反转录盒购于Thermo公司、异丙基硫代半乳糖苷（1mol/L IPTG），2000DL DNA Marker，限制性内切酶BamH I，Hind III购于TaKaRa公司、DAB显色液购于博士德生物公司，狂犬病病毒由实验室保存。
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