狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体的制备(4)
KH2PO4 0.48 g
加ddH2O至2L，调 pH至7.4，室温放置备用。
1.1.3 仪器设备
进口的PCR 反应仪购自德国Eppendorf 公司；
核酸电泳仪购于北京吹冰一公司；
紫外凝胶成像系统和蛋白电泳仪购于BIO-RAD公司；
恒温水浴锅购于上海森信有限公司；
低温台式离心机购自Eppendorf 公司；
美国sonics超声破碎仪。
1.2实验方法
1.2.1 cvs11-M的克隆
1.2.1.1引物
根据 Gen Bank上cvs11毒株M基因（序列号：ADJ29910.1）的核苷酸序列设计引物，筛选后，酶切位点选择BamH I (GGATCC)和Hind III(AAGCTT)，引物由上海生工公司合成，引物名称序列见下表。
Primer name Primer sequence
Primer-F 28a-BamH-M-F: CGCGGATCCATGAACGTTCTACGCAAGATAG
Primer-R 28a-Hind3-M-R: CCCAAGCTTTTATTCTAGAAGCAGAGAAGAG
1.2.1.2 cvs11株M蛋白基因的扩增回收
cDNA制备：
使用Trizol法提取RNA：1）取适量狂犬病病毒液，加入1mL Trizol，轻轻混匀充分；2）加入200μL 三氯甲烷，剧烈震荡15s 后，室温静置2-3min；3）4℃ 12000r/min 离心15min；4）取450μL 上清，加入等体积异丙醇沉淀RNA，稍微混匀，室温放置5min，4℃，12000 r/min 离心10+1min；5）弃去上清后，1mL 70%乙醇处理沉淀（RNA）（上下轻柔颠倒），4℃，7500r/min 离心5min；6）弃去上清；同步骤5）；7）弃掉上清，待酒精挥发后，加入15-20μL DEPC水，室温静置10min，取2μL测浓度后立即进行反转录；
反转录：取上述提取的总RNA 1μg，分别向其中加入12μL ddH2O，随机引物1μL，将该混合液混合均匀后，置于65℃水浴锅中孵育5min 后，冰上复性2min。
5×Reaction Buffer 4μL
dNTPs (10mM） 2μL
Ribolock RNase Inhibitor 1μL
RevertHid M-Mul VRT 1μL
上述配的体系 12μL
Total Volume 20μL
PCR仪器中扩增循坏参数：25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min。cDNA制备完成。接下来进行PCR扩增
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